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生物组织细胞RNA分离技术

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CONTENTS

01

样本制备规范

02

裂解方法选择

03

RNA纯化技术

04

质量检测体系

05

常见问题处理

06

应用场景延伸

01

样本制备规范

组织快速冷冻处理

避免组织反复冻融

在RNA提取前，避免组织样本反复冻融，以免RNA降解。

03

将组织样本浸泡在RNAlater等专用试剂中，可立即稳定RNA，防止降解。

02

使用RNAlater等试剂浸泡

采集组织后立即投入液氮中速冻

迅速降低组织温度，防止RNA降解。

01

细胞裂解前预处理

将组织样本进行匀浆处理，提高细胞裂解效率，使RNA释放更充分。

匀浆处理

根据样本类型和实验需求，选择合适的细胞裂解液，确保RNA的完整性和纯度。

使用合适的裂解液

在裂解前，需去除样本中的外源物质，如蛋白质、多糖等，以减少对RNA提取的干扰。

去除杂质

RNase污染防控措施

使用无RNase的试剂和耗材

在RNA提取过程中，所有试剂和耗材需经过严格处理，确保无RNase污染。

佩戴手套和口罩

专用实验区域和设备

操作人员需佩戴手套和口罩，避免皮肤、唾液等污染源与样本接触。

RNA提取应在专用实验区域进行，使用专用实验设备和器具，避免交叉污染。

1

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02

裂解方法选择

机械破碎技术

匀浆器

利用高速旋转的刀片或研磨珠，将细胞破碎成匀浆，适用于软组织和细胞悬液。

01

超声波破碎仪

利用超声波的振动能量，破坏细胞壁和细胞膜，释放RNA，适用于小量样品处理。

02

研磨法

通过研磨和摩擦的方式，破坏细胞壁和膜，适用于较硬的组织或样品量较大的情况。

03

化学裂解液配制

一种强力的蛋白质变性剂，能够破坏细胞结构，使RNA释放出来，但需要后续处理去除。

盐酸胍

表面活性剂

弱碱性溶液

如SDS、Triton等，能够破坏细胞膜和细胞内的脂质结构，释放RNA，但可能影响RNA的完整性和纯度。

如异硫氰酸胍、苯酚等，可使细胞内外pH发生变化，破坏细胞结构，释放RNA，但需注意RNA在碱性条件下的稳定性。

蛋白酶K消化方案

蛋白酶K能够分解蛋白质，使细胞内的蛋白质降解，有利于RNA的释放和纯化，但需要严格控制消化时间和温度，避免RNA被降解。

蛋白酶K消化

蛋白酶K和表面活性剂联合使用，能够更有效地破坏细胞结构和释放RNA，同时降低RNA被降解的风险。

蛋白酶K与表面活性剂联合使用

在蛋白酶K消化的基础上，采用酚氯仿抽提，可以进一步去除蛋白质和其他杂质，提高RNA的纯度。

蛋白酶K消化后进行酚氯仿抽提

03

RNA纯化技术

离心柱层析原理

原理

利用不同物质在离心场中的沉降速度不同，将RNA与其他细胞成分分离开来。

适用范围

适用于细胞总RNA的提取，对于mRNA等特定类型的RNA提取效果可能不理想。

优点

操作简便、快速，不需要使用有毒的有机溶剂，对RNA的完整性有较好的保护。

缺点

对于含量较低的RNA，可能需要多次重复操作才能获得足够的量；离心柱的吸附能力可能受到样品中其他成分的影响。

磁珠法操作流程

磁珠种类：根据RNA的特性和提取要求，选择不同类型的磁珠，如硅胶磁珠、磁珠表面修饰有特异性化学基团等。

磁珠与RNA的结合：在适当的条件下，磁珠表面的化学基团与RNA分子发生特异性或非特异性结合，形成磁珠-RNA复合物。

磁珠洗涤与RNA洗脱：通过洗涤去除与磁珠结合的杂质，然后在特定的条件下将RNA从磁珠上洗脱下来。

优点：操作简便、快速，可自动化操作，对RNA的纯度较高；且可处理小体积样品。

缺点：磁珠的成本较高，且可能对RNA造成一定的损失或降解；对于某些特殊类型的RNA，可能需要特定的磁珠才能实现有效结合。

有机溶剂选择

优点

缺点

沉淀与洗涤

溶剂萃取

有机溶剂纯化步骤

根据RNA的特性和提取要求，选择适当的有机溶剂，如酚、氯仿等。

将细胞裂解后，加入有机溶剂进行萃取，使RNA从细胞中释放出来，并与其他细胞成分分离。

通过加入无水乙醇等沉淀剂使RNA沉淀下来，然后用75%乙醇等洗涤沉淀，去除残留的有机溶剂和其他杂质。

成本较低，操作简单，对RNA的提取效率较高；且可根据需要灵活调整有机溶剂的种类和浓度。

操作过程中可能产生有毒气体，对操作人员和环境造成危害；且有机溶剂可能对RNA造成一定的损失或降解；同时还需要注意防火和防爆措施。

04

质量检测体系

分光光度计浓度检测

利用RNA在260nm处的吸收峰，测量RNA浓度，操作简便快捷。

紫外吸收法

利用荧光染料与RNA结合后的荧光强度来测定RNA浓度，灵敏度更高。

荧光染料法

避免样品中残留的盐类、蛋白质、酚等干扰物质对测量结果的影响。

注意事项

琼脂糖电泳完整性验证

电泳原理

在电场作用下，RNA分子向正极移动，通过比较不同分子量RNA的移动距离来评估RNA的完整性