第二节基因工程的酶学基础.pptVIP

第三节DNA聚合酶和反转录酶一、大肠杆菌DNA聚合酶I用途：1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA其中用途2)和3)常用大片段第63页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（一）基本性质大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即Klenow片段。Klenow片段仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。第64页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（二）用途1.3’端补平：补平限制性内切酶切后形成的3’隐蔽端。2.DNA3’末端标记:在3’隐蔽端加上放射性标记的dNTP。5’klenowklenow5’第65页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶二、Klenow片段（二）用途3.cDNA第二链的合成mRNAcDNA第一链逆转录cDNA第二链klenow5’3’3’5’5’3’引物第66页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（一）T4DNA酶的基本特性有3`→5`的核酸外切酶活性和5`→3的DNA聚合酶活性（降解单链更快）。在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位第67页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶三、T4噬菌体DNA聚合酶（二）用途第68页，共92页，星期日，2025年，2月5日第三节DNA聚合酶和反转录酶四、T7噬菌体DNA聚合酶与测序酶（一）T7噬菌体DNA聚合酶从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成，已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个。（二）T7噬菌体DNA测序酶通过对T7DNA聚合酶进行化学修饰，去除3’?5’外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。第69页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶3.平头末端第31页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶PvuII等产生的平头末端5‘…G--C--T--C--A--G--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--G--A--C--C--T--C…5’PvuII37℃5‘…G--C--T--C--A--G--OHP--C--T--G--G--A--G…3’3‘…C--G--A--G--T--C--POH--G--A--C--C--T--C…5’第32页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶第33页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶四、Ⅱ限制性核酸内切酶的基本特性（二）切割方式同裂酶（isoschizomers）：指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生不同或相同的末端。同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性末端)。第34页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶同尾酶举例：如：BamHIGGATCCBglIIAGATCTMboI,Sau3AINGATCN常用的限制酶BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、Sau3AⅠ和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。第35页，共92页，星期日，2025年，2月5日第一节限制性核酸内切酶五、Ⅱ限制性核酸内切酶的反应条件1