第十章基因重组要.pptVIP

左下角处有超级链接到配伍末端mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT目录第62页，共92页，星期日，2025年，2月5日（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建第63页，共92页，星期日，2025年，2月5日BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接目录第64页，共92页，星期日，2025年，2月5日不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4DNA连接酶15oC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。目录第65页，共92页，星期日，2025年，2月5日2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端第66页，共92页，星期日，2025年，2月5日目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15oC重组体载体自连目的基因自连目录第67页，共92页，星期日，2025年，2月5日3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。第68页，共92页，星期日，2025年，2月5日5′3′3′5′载体DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或机械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′3′3′5′5′3′A(A)nAA(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4DNA连接酶15oC重组体目录第69页，共92页，星期日，2025年，2月5日4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。第70页，共92页，星期日，2025年，2月5日人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录第71页，共92页，星期日，2025年，2月5日受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection)（四）重组DNA导入受体菌第72页，共92页，星期日，2025年，2月5日（五）重组体的筛选1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等第73页，共92页，星期日，2025年，2月5日(插入失活法)抗药性标记选择目录第74页，共92页，星期日，2025年，2月5日组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救目录第75页，共92页，星期日，2025年，2月5日α互补目录第76页，共92页，星期日，2025年，2月5日α互补的检测目录第77页，共92页，星期日，2025年，2月5日原位杂交目录第78页，共92页，星期日，2025年，2月5日Southern印迹目录第79页，共92页，星期日，2025年，2月5日鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录第80页，共92页，星期日，2025年，2月5日重组DN