核酸提取与鉴定.pptVIP

5、试剂盒快速提取法裂解液含胍盐，抑制RNA酶，使蛋白质和DNA同时变性；氯仿等抽提去除蛋白质和DNA；乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA；此法操作简便快速。第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日Trizol一步提取总RNA：TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌处理）配制的75%乙醇4℃预冷；步骤：2）1mlTrizol匀浆好的样品；3）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀（15秒）——“慢”，氯仿使蛋白变性4）室温，静置3分钟；5）离心机4℃、14000转/分，离心15分钟；静置1分钟（分层即可；样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要存在于水相中）6）取上清0.5ml（注意：取最上层水相，小心污染，宁可吸少点也不要吸到中间层的物质）放入另一个1.5ml的EP管中；7）加入等体积的异丙醇（0.5ml），涡旋混匀；第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）9）离心机4℃、14000转/分，离心10分钟10）弃上液(移液器调至1ml，分两步快速轻轻吸弃上清：第1步，沿液面吸弃约0.9ml上清；第2步，沿液面吸弃其余上清;注意吸头不要接触到沉淀斑区）11)沿试管内壁轻轻加入1ml4℃预冷的75%乙醇,注意切勿冲击到沉淀斑区12）离心机4℃、10000转/分，离心5分钟13）弃上液（用枪把里面的乙醇吸去，留极少许即可，以防干燥过程中把RNA烤干），60℃恒温箱干燥5分钟（注意：打开管盖；或用真空干燥5分钟）14）加入50μlDEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的多少加DEPC处理水）15）-80℃冰箱保存。第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日组织匀浆第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日（二）mRNA的提取从总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）层析柱。mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再用低盐浓度洗脱mRNA。第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日（一）核酸浓度检测OD260＝1时（比色皿厚度1.0cm）双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA(μg/ml)=OD260×50RNA（μg/ml）=OD260×40五、核酸的鉴定第37页，共51页，星期日，2025年，2月5日（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）核酸在260nm处有吸收峰，蛋白质在280nm有吸收峰核酸的纯度用OD260/OD280比值表示。DNA样品：OD260/OD280＝1.8，DNA纯度高OD260/OD2801.8，含RNA，或DNA部分降解OD260/OD2801.8，含苯酚或蛋白杂质RNA样品：OD260/OD280＝1.8~2.0—RNA纯度高1.8，含蛋白杂质；2.0，RNA出现降解第38页，共51页，星期日，2025年，2月5日（三）核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上RNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带，其中28srRNA的亮度应为18srRNA的两倍，5srRNA较弱。电泳：带电颗粒在电场的作用下发生迁移。第39页，共51页，星期日，2025年，2月5日第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日1核酸的提取与鉴定第一节预处理第二节DNA的提取第三节RNA的提取第四节核酸的鉴定概述第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA过程：裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如蛋白质、盐等一、概述总