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ICS65.150B50/59
DB5101
四川省成都市地方标准
DB5101/T52—2019
鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒逆转录-
聚合酶链式反应检测方法
2019-03-25发布2019-03-26实施
成都市市场监督管理局发布
I
DB5101/T52-2019
目次
前言 II
1范围 1
2规范性引用文件 1
3试剂和耗材 1
4仪器和设备 2
5IHNV的PCR鉴定 3
6结果判定 4
附录A(规范性附录)试剂配制 5
附录B(资料性附录)IHNV的G基因的全序列(1527bp) 6
DB5101/T52-2019
II
前言
本标准编写按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由成都市农业农村局提出。
本标准主要起草单位:成都市农林科学院、成都市动物疫病预防控制中心、四川农业大学。
本规程主要起草人:魏文燕、汪开毓、李良玉、杨马、刘家星、唐洪、苏中海、杨倩、刘韬、李敏、朱玲、周潇潇、李俐睿、何洁、杨壮志、陈健、陈霞、邓钰。
DB5101/T52-2019
1
鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒逆转录-
聚合酶链式反应检测方法
1范围
本标准规定了鲑科鱼类传染性造血器官坏死病毒(IHNV)的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测的试剂耗材、仪器设备、IHNV的PCR鉴定和结果判定。
本标准适用于成都市行政区域范围内鲑科鱼类IHNV的检测鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682-2008分析实验室用水国家标准
GB/T18088-2000出入境动物检疫采样
3试剂和耗材
3.1IHNV参考毒株G基因序列
参考NCBI上公布的IHNV的G基因全长参考序列(登录号为:NC_001652)。
3.2水
实验用水应符合GB/T6682-2008,一级,并用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理,除去DNA酶和RNA酶。
3.3Taq酶
-20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。
3.4dNTP
-20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化,浓度为10mmol/L。
3.5逆转录酶AMV
活力单位:40U/μL;-20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。
3.6RNA酶抑制剂(Ranase)
活力单位:40U/μL;-20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。
3.7引物
2
DB5101/T52-2019
3.7.1所选取的基因编码IHNV的糖蛋白(G基因),采用一对特异性引物,扩增目标片段全长1527bp,浓度为40μmol/L。
3.7.2上游引物F:5’-ATGGACACCATGATCACCACTCC-3’;
3.7.3下游引物R:5’-TTAGGACCGGTTTGCCAGGTGATAC-3’。
3.8无水乙醇
分析纯,使用前预冷到-20℃。
3.9矿物油
分析纯。
3.10溴酚蓝
3.11Trizol
4℃保存。
4仪器和设备
4.1PCR扩增仪。
样品台温度范围:0℃~105℃;4℃保温;温度精度:设定温度±0.5℃;梯度范围:30℃~100℃;温度均匀性:±0.5℃(孔间温度差),在30秒内达到目标温度;温度差异范围:1℃~25℃。
4.2电泳仪。
输出范围:0V~250V;最大功率:250W;与水平电泳槽相容;适用1%或3%琼脂糖;适用TBE或TAE缓冲液;带或不带溴化乙锭。
4.3紫外透射仪。
紫外波长:302nm;暗箱式。
4.4普通冰箱。
冷冻工作温度:-20℃;冷藏工作温度:4℃。
4.5超低温冰箱。
工作温度:-70℃~-80℃。
4.6台式离心机。
转速范围200rpm~12000rpm;最大离心力12000(×g);转速精度:±50r/min;温度设置范围:-10℃~40℃。
4.7电子天平。
量程:≤120g;分度值:0.001g。
4.8低温高速离心机。
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3
最高转速:≥12000rpm;最大离心力:≥12000(×g);温度控制范围:-40℃~30℃。
4.9微量移液器及吸头。
规格分别为:1000μL,200μL,10μL;吸头需无酶化处理。
4.1
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