目的基因的获得.pptVIP

**cDNA克隆中使用的反转录酶AMV：来源于禽类的成髓细胞瘤病毒MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白血病病毒天然来源的酶缺乏持续合成能力，但具有内在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生产全长的cDNA天然来源的酶，发挥功能的最适温度是37℃，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止——这些结构往往出现在5端或3端的非翻译区（这样就不容易形成全长cDNA）第28页，共40页，星期日，2025年，2月5日**现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产全长cDNA现在常用突变了的反转录酶（老鼠病毒来源的），它们缺乏RNaseH活性，因此更有利于生产全长cDNA如：LifeTechnologies公司生产的改造后的Super-ScriptII可以在50℃下进行反转录。第29页，共40页，星期日，2025年，2月5日DevelopmentofcDNAcloningstrategiesAnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.(早期的策略：发卡方法：引导cDNA第二链的合成)**ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.(改进的策略：寡聚加帽法：对cDNA第一链同聚物加尾后，设计相对应的引物合成cDNA第二链)**第30页，共40页，星期日，2025年，2月5日早期cDNA策略**mRNA的分离Oligo(dT)引物与mRNA退火，cDNA第一链合成降解mRNA模板，cDNA3’末端形成双链发夹结构以发夹结构为引物，合成cDNA第二链用S1核酸酶去掉发卡结构缺点：S1核酸酶的作用，会使cDNA5’端的序列部分丢失*第31页，共40页，星期日，2025年，2月5日**合成的cDNA双链通过同聚物加尾的方式与载体相连后导入宿主细胞中1976年，发卡方法的严重缺陷：S1核酸酶的切割会使克隆的5’端某些序列丢失。因此后来有了另一种方法。*第32页，共40页，星期日，2025年，2月5日**改进的cDNA克隆策略寡聚T引物在mRNA多腺苷酸尾部退火首条cDNA链的合成在cDNA第一条链的末端(3’端)加上oligo(dC)末端转移酶合成相应的寡oligo(dG)引物引导第二条cDNA的合成*第33页，共40页，星期日，2025年，2月5日**ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.改进的cDNA克隆策略。第一条cDNA链用寡聚C加尾，使第二条链可以有寡聚G初始化。*第34页，共40页，星期日，2025年，2月5日举例第35页，共40页，星期日，2025年，2月5日3化学合成法多用于合成短的DNA片段，如引物、DNA探针等。DNA合成仪磷酸二酯法亚磷酸三酯法寡核苷酸的连接第36页，共40页，星期日，2025年，2月5日化学合成的产物引物：合成目的基因的引物和测序引物第37页，共40页，星期日，2025年，2月5日第5章目的基因的获得第3章目的基因的获得第3章目的基因的获得目的基因的获得第1页，共40页，星期日，2025年，2月5日contents第2页，共40页，星期日，2025年，2月5日3.1从基因组DNA获得目的基因碱抽提法提取总DNA层析法获得细胞总RNA核酸的定量和纯度测定第3页，共40页，星期日，2025年，2月5日核酸电泳装置—电泳仪第4页，共40页，星期日，2025年，2月5日核酸电泳装置—电泳槽、倒胶板第5页，共40页，星期日，2025年，2月5日耗材第6页，共40页，星期日，2025年，2月5日大肠杆菌总DNA的提取1.Pellet0.1gor2mL菌液，+TEbuffer(10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)450μL+10%