核酸的理化性质.pptVIP

多核苷酸中磷酸二酯键中的磷酸基团只有一个解离常数第25页，共71页，星期日，2025年，2月5日4、核酸的滴定曲线图14-2小牛胸腺DNA的滴定曲线反映出变性DNA的滴定曲线改变碱基的暴露II从pH12或pH2.5分别反向滴定I从pH6.9用酸或碱正向滴定I天然II变性电极电位的变化，指示离子浓度的变化第26页，共71页，星期日，2025年，2月5日由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。第27页，共71页，星期日，2025年，2月5日三、核酸的紫外吸收性质两类核酸的紫外吸收谱均为260~290nm其最高吸收峰接近260nm第28页，共71页，星期日，2025年，2月5日DNA的紫外吸收谱光吸收（A）波长/nm1是天然DNA;2是变性DNA；3是核苷酸总吸收值第29页，共71页，星期日，2025年，2月5日小量DNA或RNA的紫外吸收法定量测定1、?对待测样品是否纯的判断可用紫外分光光度计读出260nm和280nm的A值，计算A260/A280，从此值大小判断样品的纯度，纯的DNA的A260/A280应为1.8；纯的RNA应为2.0。2、?对纯核酸样品的定量测定只要测出260nm的A值，即可计算含量。通常以1个A单位相当于50ug/ml双螺旋DNA；或40ug/ml的单链DNA(或RNA)；或20ug/ml的寡核苷酸（或单核苷酸）。第30页，共71页，星期日，2025年，2月5日四、核酸的变性、复性与杂交(一)核酸的变性（denaturation）1、DNA的变性：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。第31页，共71页，星期日，2025年，2月5日某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，使核酸分子高级结构改变、理化性质及生物活性发生改变。不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2、变性的实质第32页，共71页，星期日，2025年，2月5日降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂第33页，共71页，星期日，2025年，2月5日DNA变性第34页，共71页，星期日，2025年，2月5日高温（一般＞75℃）—热变性强酸、碱—酸碱变性甲醛（Agarose中RNA）尿素（PAGE中DNA）3、变性因素原理：与蛋白质变性相似，破坏空间结构中的次级键第35页，共71页，星期日，2025年，2月5日OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失4、变性后理化性质变化第36页，共71页，星期日，2025年，2月5日第37页，共71页，星期日，2025年，2月5日完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA25－40%、RNA约1.1%实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应提供了一个很好的检测变性的方法！第38页，共71页，星期日，2025年，2月5日变性RNA酶的分数是根据溶液的特性粘度增加、在365nm的旋光度变化和287nm紫外吸收变化变性RNA酶的分数温度Tm第39页，共71页，星期日，2025年，2月5日5、DNA热变性的特征变性过程是“跃yue变式”的，而非渐变解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。第40页，共71页，星期日，2025年，2月5日指增色效应达50%时的温度一般DNATm值在85-90?C之间Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。第41页，共71页，星期日，2025年，2月5日（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：经验公式：XG+C＝（Tm－69.3）×2.44（3）介质中的离子强度：Tm值大小与下列因素有关：第42页，共71页，星期日，2025年，2月5日（1）DNA的均一性。均质DNA，如一些病毒DNA，人工合成的poly(A-T)、poly(G-C)的熔解过程发生在一个较小的温度