第三章基因工程的酶学基础.pptVIP

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衔接物连接法第62页,共119页,星期日,2025年,2月5日双衔接物:可以实现定向克隆,防止发生自连,同时对克隆片断的再删除也比较方便。第63页,共119页,星期日,2025年,2月5日双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列,由Klenow补齐,加入第二衔接物EcolI第64页,共119页,星期日,2025年,2月5日在用DNA衔接物连接法时,如果待克隆DNA的片断或基因内部,含有与所加衔接物相同的限制位点,在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时,也会把克隆的基因切断。第65页,共119页,星期日,2025年,2月5日(4)DNA接头(adapter)连接法:1978年,美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端,进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P,暴露出5’-OH,不能产生稳定的二聚体分子。第66页,共119页,星期日,2025年,2月5日第67页,共119页,星期日,2025年,2月5日DNA接头连接法第68页,共119页,星期日,2025年,2月5日(5)热稳定的连接从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。可明显的降低形成非特异性连接产物的几率,在85度下具有酶活性。重复升温94度之后仍具有酶活性。第69页,共119页,星期日,2025年,2月5日寡核苷酸连接测定(oligonucletideligationassay,OLA)用两个寡核苷酸探针,同已知序列的靶DNA杂交,探针在靶DNA分子的位置是相邻的。探针长度是20~25bp连接酶链式反应(lingasechainreaction,LCR)连接扩增反应(lingaseamplicationreaction)用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物。第70页,共119页,星期日,2025年,2月5日寡核苷酸连接测定AGTGACCTTCACTGGAAGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGAAGTGACCTACCTAGTGACCTACCT待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基生物素磷酸BBBBDDPP阳性信号无信号链霉抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的取代、插入、及缺失而引起的多态性碱性磷酸酶碱性磷酸酶底物第71页,共119页,星期日,2025年,2月5日LCR:ligasechainreaction,连接酶链式反应。样品DNA、探针(4)94度变性、NAD55度退火第72页,共119页,星期日,2025年,2月5日三、DNA聚合酶第73页,共119页,星期日,2025年,2月5日常用的DNA聚合酶:大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶等。第74页,共119页,星期日,2025年,2月5日共同点:把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用,而不发生从引物模板上

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