第五章PCR实验中的样本制备.pptVIP

（一）RNA提取所用器皿的处

理及溶液的准备

经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管，离心管等基本上无RNase，可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA，实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染，使用前必须于180℃干烤8小时以上，或用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯，试管和其它用品。第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上良量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日要注意的是，DEPC有致癌性，操作时须小心。对于RNA提取所需溶液的配制，必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNase的玻璃器皿。第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日可能的话，溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟.须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液.第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日（二）RNA提取中RNase污染的控制

实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。因此，在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时，以及在涉及RNA的整个提取操作过程中，都应戴一次性手套。第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日实验中，如触摸“脏的”玻璃器皿和其它物品以后手套就可能会沾染上RNase，因此在RNA提取实验中，应勤换手套。常用的RNase抑制剂有以下几种：第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日1．RNase的蛋白质抑制剂这种RNase的蛋白质抑制剂是从人胎盘分离得到，可与多种RNase以非共价方式紧密结合，从而使RNase失活。其可置于含5mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的50%甘油中，贮存于-20℃。第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日2．钒核糖核苷复合物这种复合物由氧钒（IV）离子和4种核糖核苷之中的任一种所组成，能与多种RNase结合，并几乎能百分之百地抑制RNase的活性。第37页，共82页，星期日，2025年，2月5日3．硅藻土硅藻土是一种粘土，通过吸附RNase而去除其降解RNA的作用。第38页，共82页，星期日，2025年，2月5日（三）RNA提取方法

RNA提取的常用方法有：（1）表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法；（2）胍盐提取结合氯仿-酚抽提法；（3）胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。第39页，共82页，星期日，2025年，2月5日第一种方法所提取的RNA纯度高，反转录（RT）-PCR扩增的特异性好，缺点是操作繁琐，易造成微量标本的丢失或标本间的交叉污染，还易因RNA降解而影响测定结果的可靠性及敏感性；第40页，共82页，星期日，2025年，2月5日第三种方法较为方便省时，不需氯仿-酚抽提，但对玻璃粉、二氧化硅等的质量有要求；第二种方法虽较为复杂，但结果稳定性最优，因为使用强烈变性剂加盐酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破环而从核酸上解离下来。第41页，共82页，星期日，2025年，2月5日RNase可耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L硫氰酸胍和β-巯基乙醇等还原剂所灭活，因此可联用上述试剂从组织中提取完整无损的RNA。下面以血清（浆）的异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚说明RNA常用提取方法。第42页，共82页，星期日，2025年，2月5日异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法第43页，共82页，星期日，2025年，2月5日（1）试剂

20%PEG6000

裂解液：

4mol/LGuSCN,

25mmol/L柠檬酸钠pH7.0,

0.5%Sarkosyl（十二烷基肌酸钠）

100mmol/Lβ-巯基乙醇

饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1）3mol/LNaAcPH5.2

无水乙醇

75%乙醇

DEPC处理的无菌去离子水

RNasin（RNA酶抑制剂）第44页，共82页，星期日，2025年，2月5日（2）操作步骤

200μl血清（浆）

加入200μl20%PEG6000

4℃3小时，12000rpm离心15