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粮油检验粮食中γ-氨基丁酸的测定高效液相色谱法

1范围

本文件描述了测定粮食中γ-氨基丁酸的高效液相色谱法。

本文件适用于糙米、大米、大豆等粮食中γ-氨基丁酸的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

γ-氨基丁酸经乙醇水溶液提取，4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯衍生，净化后用高效液相色谱在436nm下测定γ-氨基丁酸含量。

5试剂和材料

除非另有说明，在分析中所用试剂均为分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1无水乙醇(C2H5OH)：色谱纯。

5.1.2乙腈(CH3CN):色谱纯。

5.1.3碳酸氢钠（NaHCO3）。

5.1.4冰醋酸（CH3COOH）。

5.1.5三水合乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。

5.1.64-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯（C14H14ClN3O2S）：色谱纯。

5.2试剂配制

5.2.180%乙醇溶液（4+1，V+V）：量取800mL无水乙醇与200mL水混匀。

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5.2.2碳酸氢钠溶液(0.476mol/L)：称取0.40g碳酸氢钠，用水溶解并定容至10mL，现配现用。

5.2.34-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯溶液(2mg/mL)：称取4-二甲基胺基偶氮苯-4-磺酰氯20mg，用乙腈溶解并稀释定容至10mL，现配现用。

5.2.4三水合乙酸钠溶液：称取6.80g三水合乙酸钠，用水溶解并定容至1L，用冰醋酸调节溶液pH至5.50，经过0.45μm水型滤膜过滤后使用。

5.3标准品

γ-氨基丁酸（C4H9NO2，CAS号：56-12-2）：纯度≥98.0%,或具有标准物质证书的标准物质。

5.4标准溶液配制

5.4.1标准储备溶液(1000μg/mL)：准确称取γ-氨基丁酸标准品10.0mg(精确到0.1mg)，用80%乙醇溶解转移到10mL容量瓶中定容。冷藏于2℃~8℃冰箱内，可保存3个月。

5.4.2标准中间溶液(100μg/mL)：准确吸取标准储备溶液1mL置于10mL容量瓶中，用80%乙醇稀释并定容至刻度，混匀，现用现配。

5.4.3标准系列工作溶液：准确吸取标准中间溶液0.025mL、0.125mL、0.25mL、0.5mL、1.25mL、2.5mL、5mL至25mL容量瓶中，用80%乙醇定容。得到标准曲线工作溶液浓度分别为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，现用现配。

5.5仪器和设备

5.5.1高效液相色谱仪：配备紫外检测器或二极管阵列检测器。

5.5.2分析天平：感量为0.01g、0.001g和0.0001g。

5.5.3粉碎设备：能将样品粉碎，使其能全部通过筛孔孔径为0.25mm(60目)的筛。

5.5.4涡旋混合器：转速≥2500r/min。

5.5.5离心机：转速≥8000r/min。

5.5.6恒温水浴锅：70℃±1℃。

5.5.7具盖离心管：2mL和50mL。

5.5.8注射器：2mL。

5.5.90.22μm水型滤膜针头滤器。

5.5.100.45μm水型滤膜。

6分析步骤

6.1样品的扦样、分样

按GB/T5491执行。

6.2试样制备

样品经混匀后，缩分至约50g，经研磨至全部通过孔径0.25mm(60目)筛的试样，混匀，装入密闭容器中，室温下避光保存。

6.3试样处理

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称取1g（准确至0.001g）样品于50mL具盖离心管中，加入20mL80%乙醇溶液，涡旋振荡30min后，于8000r/min离心10min，将上清液转入50mL容量瓶中。样品残渣再用20mL80%乙醇溶液提取1次，合并2次提取液，用80%乙醇溶液定容至50mL，摇匀，待衍生化。

6.4衍生化

准确吸取1.0mL待测溶液于2mL具盖离心管中，加入0.2mL碳酸氢钠溶液和0.4mL4-二甲基胺基偶氮-4-磺酰氯衍生试剂，混匀后在70℃水浴衍生反应20min，冷却