分子生物学实验.pptxVIP

分子生物学实验安排

实验项目2020E.coli重组表达GFP；012021利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP；022022组装慢病毒表达目的蛋白。03

总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNART-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞原核诱导表达GFP：构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。构建克隆RFP的慢病毒：GFP的表达与鉴定第2周第3周第4周

序号实验内容并行实验1（上午）总RNA的抽提2RT-PCR克隆pET28a质粒的制备3（下午）PCR产物的纯化4PCR产物的酶切和回收pET28a质粒的酶切回收5构建重组质粒pET28a-eGFP：载体和克隆片段的连接6BL21(DE3)感受态细胞制备

序号实验内容并行实验1（上）pET28a+eGFP连接产物转化BL21(DE3)2pFastBacHTA质粒的抽提及酶切和纯化3（下）构建重组质粒pFastBacHTA-eGFP：载体和克隆片段的连接4pFastBacHTA+eGFP连接产物转化TG1513日下午挑斑接种培养

序号实验内容并行实验1（上午）菌液PCR鉴定重组克隆2pET28a-eGFP的抽提pFastBacHTA-eGFP的抽提3（下午）重组质粒的酶切鉴定4pET28a-eGFP双酶切pFastBacHTA-eGFP双酶切5pFastBacHTA-eGFP转化DH10Bac6重组克隆诱导表达

序号实验内容并行实验1（上午）SDS分析重组蛋白的表达2（下午）WesternBlot鉴定重组蛋白320日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养

重组Bacmid的抽提与鉴定

时间节点：3月26日Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒01慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒023日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。03

试剂安排0102030469人上课按照4人一组进行分组，共17组教室：512；517.每组一套试剂和工具

目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。试剂：细胞：每组一瓶Trizol：RNAiso氯仿：异丙醇DEPC水70%的乙醇：DEPC水配制DNase/RNase-FreeTipsandTubes逆转录酶：引物DEPC水dNTPmix

操作注意事项：涉及RNA的操作时尽量不要在四周走动；取用试剂后及时封盖。涉及RNA的操作时尽量不要开口说话；全程戴一次性手套操作；

操作步骤细胞匀浆：感染病毒4天的sf9细胞剧烈摇晃细胞瓶使细胞脱落下来；每人取1ml细胞培养物于RNase和DNaseFree的EP管中；1000rpm，4?C离心5min；弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟；加入1ml的RNAisoPlus，反复振荡数次使细胞完全裂解；可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。室温静置5分钟。

TotalRNA的提取向匀浆裂解液中加入200?L氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量），盖紧离心管盖；用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）；待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。12,000g，4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管（勿晃动），此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟。12,000?g，4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

01RNA沉淀的清洗小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75％乙醇1ml（切勿触及沉淀）；轻轻上下颠倒数次，12,000?g，4℃离心5分钟后小心弃去上清；0203

RNA的溶解室温自然晾干沉淀2～5分钟加入20?l的RNase-free水溶解沉淀必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80℃保存，或暂时于冰上保存。取10?l总RNA与10xLoadingBuffer混合与1%agarosegel凝胶电泳。100V，电泳20min，拍照记录。剩余的RNA样品用于RT-PCR

二、RT-PCR克隆目的基因输入标题逆转录合成第一链cDNA；输入标题输入标题输入标题制备目的DNA克隆片段2PCR扩增目的基因；PCR产物的纯化；143

建议：大家使用3?L总RNA样品

试剂浓度用量H2O/3510xPCRbuffer/5dNTPmix10mM1引物110?M2引物210?M21stcDNA3TaqDNA酶2U/?l1总体积501、PCR反应体系

30次循环充分混