蛋白质的定性定量分析及保存.pptVIP

1.SDS测定分子量基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4gSDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。?＝q/f＝q/6?r?，所有蛋白质的迁移率都相同。第27页，共66页，星期日，2025年，2月5日在SDS中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移第28页，共66页，星期日，2025年，2月5日第29页，共66页，星期日，2025年，2月5日第30页，共66页，星期日，2025年，2月5日在半对数坐标纸上做出标准曲线注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。第31页，共66页，星期日，2025年，2月5日2.凝胶过滤层析法测定分子量蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：lgMr＝K1－K2Ve在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lgMr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。第32页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS与凝胶过滤法是互补的凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。第33页，共66页，星期日，2025年，2月5日例如：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kDSDS（不加还原剂）结果：45kDSDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD）则结论是：该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。第34页，共66页，星期日，2025年，2月5日3.质谱法是最精确的分子量测定方法质谱（MassSpectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。第35页，共66页，星期日，2025年，2月5日第36页，共66页，星期日，2025年，2月5日第三节纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存第37页，共66页，星期日，2025年，2月5日一、蛋白质的浓缩超滤法使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。第38页，共66页，星期日，2025年，2月5日冷冻干燥法在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。第39页，共66页，星期日，2025年，2月5日吸收法采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。沉淀法硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。第40页，共66页，星期日，2025年，2月5日5.其它方法浓缩胶浓缩法离子交换法吸附法蒸发法第41页，共66页，星期日，2025年，2月5日二、蛋白质的干燥常压吸收干燥真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥第42页，共66页，星期日，2025年，2月5日三、蛋白质的保存影响蛋白质成品保存的因素：1）空气2）湿度3）水分4）光线5）pH值6）时间第43页，共66页，星期日，2025年，2月5日2.蛋白质的保存方法低温下保存制成干粉或结晶保存在保护剂下保存a.惰性的生化或有机物b.中性盐c.巯基试剂第44页，共66页，星期日，2025年，2月5日第四节蛋白质组学定量研究常见方法第45页，共66页，星期日，2025年，2月5日