生化分离高级纯化技术.pptVIP

B、亲和吸附介质将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面（孔内），该固体粒子通常称配基的载体（carriersupport），亲和层析介质又称亲和载体（affinitycarrier,affinitysupport）。作为载体的固体粒子应该满足的条件：具有亲水多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大；理化稳定性高，机械强度高，使用寿命长；含可活化的反应基团，用于亲和配体的固定化；粒径均一的球形粒子。合成氢和介质的方法：溴化腈活化法、环氧剂活化法、硅胶活化法第30页，共63页，星期日，2025年，2月5日四、亲和层析分离过程A、特异性吸附：A、样品开始加到亲和层析柱时，欲分离的大分子物质在柱中的浓度等于零；开始进入柱中时，配体和与分离的大分子物质间相互接触，并形成复合物，也有部分复合物分解。B、样品不断通过柱时，欲分离的大分子物质与配体形成的复合物浓度越来越大。C、由于配体的存在使欲分离的大分子物质受阻，导致产生紧密的复合带。样品中有效成分在层析过程是持久逐步递增累积得以分离纯化。第31页，共63页，星期日，2025年，2月5日样品中有效成分在层析过程的吸附量，除了与其亲合力有密切关系外，还与样品的PH值和离子强度有关。第32页，共63页，星期日，2025年，2月5日B、分离大分子物质样品通过亲和层析柱后，用大量的平衡液即起始缓冲液洗去杂蛋白，也可用不同的缓冲液洗涤，柱上只有专一吸附的大分子物质。洗脱专一吸附大分子物质的条件，要能使复合物完全分离，根据亲合力来决定：①亲合力较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗脱，得到迟缓的大分子物质峰。②亲和力一般时，主要改变缓冲液的性质（改变PH值、离子强度等），使复合物之间的亲合力下降到足以分离的程度。③亲合力较强时，用与配体竞争的溶液或用蛋白质变性剂洗脱。a、竞争性洗脱剂；b、剧烈的洗脱条件（即蛋白质变性）条件。第33页，共63页，星期日，2025年，2月5日五、亲和层析柱的再生洗脱结束后，应连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，再用平衡缓冲液将层析柱重新平衡。一般亲和层析柱都可反复使用多次。木瓜蛋白酶的亲和吸附剂（甘氨酰甘氨酰酪氨酰精氨酸－琼脂糖）在4个月内可使用20次。第34页，共63页，星期日，2025年，2月5日六、纯化大分子物质实例抗体、抗原及其结合物用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要由抗原（纯化抗体）、抗体（纯化抗原）和金色葡萄球菌蛋白A第35页，共63页，星期日，2025年，2月5日第四节离子交换层析一、离子交换层析的基本原理二、离子交换剂的分类、性质三、离子交换剂与缓冲液的选择四、离子交换剂的处理、再生、转型五、分离物质的交换六、物质的洗脱与收集七、离子交换层析的应用第36页，共63页，星期日，2025年，2月5日2、离子交换剂对溶液中离子的结合力：离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行，并都是可逆的。RA＋B＋＝RB＋A＋第37页，共63页，星期日，2025年，2月5日（1）离子交换剂的选择性决定：结合力由平衡常数表示：若溶液中[A＋]的摩尔浓度与［B＋］相等时，则：①若K＞1，即［RB］＞［RA］，表示离子交换剂的结合力：B＋＞A＋；②若K＝1，即［RB］＝［RA］，表示离子交换剂的结合力：B＋＝A＋；③若K＜1，即［RB］＜［RA］，表示离子交换剂的结合力：B＋＜A＋；第38页，共63页，星期日，2025年，2月5日（2）反离子电荷平衡：①强酸性（阳性）离子交换剂对H＋的结合力比对Na＋的小；弱酸性离子交换剂相反；②强碱性（阴性）离子交换剂对OH－的结合力比对Cl－的小；弱碱性离子交换剂相反；第39页，共63页，星期日，2025年，2月5日(3)与水合离子有关：A、与水合离子的电量成正比，而与离子半径的平方成反比。B、离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力也越大。C、稀溶液中离子发生水化时，各种阴、阳离子结合力大小的排列：一价离子：Li+＜Na+＜K+＜Rb+＜Cs+(对阳离子交换剂)二价离子：Mg2+＜Ca2+＜Sr2+＜Ba2+(对阳离子交换剂)一价阴离子：F－＜Cl－＜Br－＜I－