高效液相色谱法68课件.ppt

三、高效液相色谱仪高效液相色谱仪流程由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是仪器最重要的部件：由储液罐、高压输液泵**、过滤器、压力脉动阻力器等组成。对高压输液泵的要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。1.高压输液系统常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差它们各有优缺点。目前恒流泵比恒压泵优越，使用较普遍恒流泵分机械注射泵和机械往复泵**两种高压输液泵：主要部件之一，压力：150～450×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5-30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。2．进样系统流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：准备状态进样状态流动相入口色谱柱入口样品出口样品入口流动相入口色谱柱入口样品环色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技术的性能不受影响。3、分离系统——色谱柱柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。对色谱柱的要求：柱效高，选择性好，分析速度快等。使用色谱柱注意事项：1溶剂要脱气，溶剂和样品应过滤，防止堵塞。2加前置柱。3更换流动相要渐变。4用后要保护好。HPLC与GC一样，要求检测器灵敏度高，重现性好，定量准确，对温度和流速的变化不敏感，应用范围广，线性范围宽等优点检测器分为两大类：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光等。现将常用的检测器介绍如下:4．检测系统HPLC中应用最广泛的检测器。它的原理基于待测组分对特定波长的紫外或可见光的选择性吸收，试样浓度与吸光度的关系服从朗伯-比尔定律。高效液相色谱检测器：（1）紫外光度检测器（UV）优点：灵敏度高，选择性好，对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度淋洗，线性范围宽，适用于痕量分析。最小检测量10-9g·mL-1。（1）紫外光度检测器（UV）缺点：只适用于检测能吸收紫外、可见光的物质，流动相选择受限制。要求流动相在测定波长下无吸收。检测器是一种通用型检测器。它的作用原理是纯流动相与包含样品的流动相之间的折射率不同，检测器把这种差值检测出来，给出信号，信号的大小与样品含量成正比。纯流动相与待测组分的折射率相差越大，检测器灵敏度越高，灵敏度可达10-7g·cm-3。通用性强，不破坏样品，线性范围宽。主要缺点是灵敏度低，不适宜痕量分析。对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。（2）示差折光率检测器它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置.HPLC梯度淋洗与GC中的程序升温一样。对于某些复杂样品，组分的k′范围很宽，用一种强度的溶剂淋洗时不能得到很好的分离，采用梯度淋洗。就是组成流动相的两种或两种以上不同的溶剂按一定程序改变配比、极性、pH、离子强度、通过流动相极性的变化来改变待分离样品的选择因子和tR，提高分离效果和分析速度。5、附属系统*流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空