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“”“”4.6.4双缩脲法测蛋白质含量测定蛋白质的方法双缩脲法——原理1.双缩脲的制备NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2NH2—CO—NH—CO—NH2+NH32.双缩脲反应具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。因此蛋白质在碱性溶液中，也能与Cu2+形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比，故可以用来测定蛋白质的浓度。双缩脲法——试剂1.标准曲线的绘制取6支干燥洁净比色管编号，按下表加入下列试剂：采用标准曲线法，即A540(540nm吸光度值)为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。?加入物（ml）012345标准蛋白液/ml00.20.40.60.81.0蛋白浓度/(mg/ml)02.04.06.08.010.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂/ml4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（20—25℃）放置30minA540双缩脲法——操作步骤2．样品测定取2支试管，加入待测样品液各1mL，加入双缩脲试剂4mL，室温下（20—25℃）放置30min，用分光光度计测定吸光度。3.结果计算将测得的吸光度代入标准曲线的回归方程，求得未知样品的蛋白质浓度。以mg/mL计。?注意事项1．本实验方法测定范围1－10mg/ml蛋白质。2．各管由显色到比色的时间应尽可能一致。3．有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。4.双缩脲反应产生的紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。5.双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。向试剂中加入碘化钾，可延长试剂的使用寿命。“”“”
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