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第1页,共31页,星期日,2025年,2月5日一、PCR的定义:PCR(polymerasechainreaction):聚合酶链式反应,又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。第2页,共31页,星期日,2025年,2月5日DNA扩增的传统方法:一般采用分子克隆法,需将构建的含有目的基因的载体导入细胞进行扩增,并需要用探针进行筛选,牵扯到DNA酶切、连接、转化、培养及探针杂交等技术,虽然技术上已无难点,但操作复杂,需数周到数月的时间,且不利于普及。第3页,共31页,星期日,2025年,2月5日PCR技术:1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创,可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点:敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等,广泛应用于微生物学、考古学、法医学及体育等领域,并已普及到许多普通实验室,大大简化了传统的分子克隆技术,从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。第4页,共31页,星期日,2025年,2月5日二、PCR的原理:用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段,类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成,重复这一过程,即可使目的DNA片段得到扩增。第5页,共31页,星期日,2025年,2月5日扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合,基本反应步骤分三步:1.变性(Denaturation):加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。94℃30″2.退火(复性)(Annealling):突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,也存在两条模板链之间的结合,但由于引物的高浓度,结构简单的特点,主要的结合发生在模板与引物之间。55℃30″第6页,共31页,星期日,2025年,2月5日3.延伸(Extension):将反应温度调节到酶的最适温度,在DNA聚合酶、4种dNTPs及镁离子等存在的条件下,以引物的3′端开始,结合单核苷酸,形成与模板链互补的新DNA链。72℃1′上述3步为一个循环,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~40个循环后DNA可扩增106~109倍。第7页,共31页,星期日,2025年,2月5日PCR的基本反应步骤变性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第8页,共31页,星期日,2025年,2月5日第9页,共31页,星期日,2025年,2月5日第10页,共31页,星期日,2025年,2月5日PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期,原来的DNA担负起使模板的作用,随着循环次数的递增,由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板,最终的扩增产物是介于两种引物5’端之间的DNA片段。第11页,共31页,星期日,2025年,2月5日三、PCR的成分和作用:终浓度1.缓冲液:10~50mMTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境的偏碱性25~50mMKCl促进引物退火,50mM会抑制Taq酶的活性。100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性,如质量不好将起相反的作用,建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。第12页,共31页,星期日,2025年,2月5日2.MgCl2:1.5~2.0mMTaq酶具有Mg2+依赖性,显著影响反应的特异性和扩增片段的产量,过量能增加非特异扩增并影响产率,过低则酶活性显著下降。第13页,共31页,星期日,2025年,2月5日3.dNTPs:dATP、dGTP、
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