第三章凝胶分离技术.pptVIP

5、柱结构（φ、h）的选择第30页，共51页，星期日，2025年，2月5日柱太短，影响分离效果；柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当：内径过细（小于1cm），会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果；过大（大于5cm）则稀释现象严重。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例：对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日二、凝胶分离操作技术1、凝胶装柱①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液（或洗脱液）；③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·min。⑤连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。注意：防止空气进入凝胶床第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日装柱操作注意事项：灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象，可以用玻璃棒将已经形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的地方，再继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好凝胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来，所以使用前应用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖—2000（Bluedextran-2000）通过凝胶柱，以检查形成的带色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日注1：刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶柱会产生大量的气泡影响层析。注2：在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气，在加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。注3：装好的凝胶柱，使用时应该用相当于柱体积两倍或更多的洗脱液流过洗脱柱，以压实凝胶。第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日2、样品的上柱及洗脱①加样量的控制分析：1-2ml/100ml床体积，制备：10-30ml/100ml床体积②洗脱液的选择：首先洗脱液最好与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果；水溶性物质的洗脱用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液，非水溶性物质的洗脱用有机溶剂（苯、丙酮等）。第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性，不与被分离的物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量的活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐作洗脱液。第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日第三章凝胶分离技术第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日优点：1、凝胶为不带电荷的惰性物质，不与溶质分子发生任何作用，因此分离条件温和，产物收率高，重现性好；2、应用范围广，所分离物质分子量覆盖面大，可分离从几百到数百万分子量的物质；3、设备简单，操作方便，周期短，可反复使用。凝胶分离已成为一种通用的分离方法，在生物大分子物质（蛋白质、酶、核酸、激素、多糖等）的制备与生产技术中被广泛应用。第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日第一节凝胶分离原理一、凝胶分离原理当被分离物质的分子大小不同时，能够进入到凝胶内部的能力也不同。凝胶中的孔隙大小与分子大小有相仿的数量级。当混合物通过凝胶时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子就不能进入，因此在移动速度方面就出现差异，从而使不同相对分子质量的各组分得到分离。第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日第4页，共51页，星期日，2025年，2月5日第5页，共51页，星期日，2025年，2月5日分离原理可用下式表示：VR=V0+kVi式中：VR：保留体积（洗脱体积）V0：柱床内存在于凝胶外面的水相体积——外水体积Vi：凝胶颗粒内部所含的水相体积——内水体积k：分配系数第6页，共51页，星期日，2025