第六章动物繁殖技术.pptVIP

;;;;;;;目前已有关于人、小鼠、牛等卵母细胞冷冻成功的报道，但其成功率较低。

于永存等〔2002〕报道，用玻璃化法冷冻保存牛GV期卵母细胞，解冻后其体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为21.6%、15.1%和11.1%，显著高于程序冷冻法和超快速冷冻法的效果。;;;冷冻可引起卵母细胞ZP收缩，破坏细胞骨架，损伤细胞膜和细胞内部结构的完整性，还能损伤细胞整体，阻碍极体产生，增加DNA不稳定性而导致染色体异常。

为防止此类现象的发生，一般于-7℃时采用植冰法及时启动脱水过程，从而在较高的温度下诱导形成结晶，逐渐扩散至整个溶液，防止冰晶突然形成。;;;;;〔1〕小分子物质单糖〔如葡萄糖〕，双糖〔如蔗糖、海藻糖〕，三糖〔如棉子糖〕和其它糖类。

〔2〕高分子物质聚乙烯吡咯烷酮〔PVP〕、白蛋白、左旋糖苷、聚乙烯醇〔PVA〕、羟乙基淀粉和蛋黄等。

主要通过改变渗透压，引起细胞脱水，从而发挥非特异性保护作用，又称为细胞外冷冻保护剂。;不管是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方面之一。

业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。但脱水过度，细胞也可能死亡。;理想的冷冻方案是：①找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；②适宜剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又防止“溶质效应〞；③适宜的冷冻速率。;;;Scholander等〔1957〕报道，北极鱼可以在-18℃的水中生存，它的血清的凝固点大约比这一温度高1℃，从这种动物体内别离一种抗冻蛋白〔AFP〕。目前，在植物、昆虫、细菌和真菌都发现并别离出AFP。;AFP是一种具有特殊功能的蛋白质，在低温〔4℃〕和超低温〔-130℃～-168℃〕下，能与细胞膜相互作用而保护细胞，抑制冰晶的生长，增强生物体抵御寒冷的能力。;;〔二〕冷冻保护液;;;现有保存方法有4种

常规冷冻法；

一步冷冻法；

程序冷冻法

玻璃化冷冻化

着重讲述后两种;1.常规冷冻法;1.常规冷冻法;2.一步冷冻法;3.程序冷冻法;;;4.玻璃化冷冻法;;;体视显微镜;;;