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从重组双功能水蛭素探秘新型直接凝血酶抑制剂的设计与发展

一、引言

1.1研究背景

凝血相关疾病严重威胁人类健康，是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一。随着人口老龄化的加剧以及生活方式的改变，其发病率呈逐年上升趋势。如深静脉血栓、心肌梗死、脑卒中等血栓性疾病，具有高死亡率和高致残率的特点，给患者家庭和社会带来了沉重的经济负担。

凝血酶在血栓形成过程中扮演着关键角色，是凝血级联反应的核心酶。它不仅能够催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促使血栓形成，还能激活多种凝血因子，进一步放大凝血反应。抑制凝血酶的活性，成为预防和治疗血栓性疾病的关键策略。凝血酶抑制剂作为一类重要的抗血栓药物，能够特异性地抑制凝血酶的活性，从而有效阻止血栓的形成。

传统的凝血酶抑制剂，如普通肝素和华法林，在临床应用中取得了一定的疗效，但也存在诸多局限性。普通肝素需要频繁监测凝血指标，且个体差异较大，容易导致出血等不良反应；华法林的药物相互作用多，治疗窗窄，需要严格控制饮食和定期监测凝血酶原时间。这些缺点限制了它们的广泛应用，因此，研发新型、高效、安全的凝血酶抑制剂具有迫切的临床需求。

水蛭素作为一种天然的凝血酶特异性抑制剂，从医用水蛭的唾液腺中提取而得，具有强大的抗凝活性和高度的特异性。它能够与凝血酶以1:1的比例紧密结合，形成稳定的复合物，从而不可逆地抑制凝血酶的活性。基于对天然水蛭素构效关系的深入研究，通过基因工程技术将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列融合到水蛭素分子的合理部位，构建出重组双功能水蛭素。这种新型分子不仅保留了天然水蛭素的抗凝血酶活性，还赋予了其抗血小板聚集的功能，为血栓性疾病的治疗提供了新的思路和方法。

对重组双功能水蛭素的结构与功能进行深入研究，不仅有助于揭示其作用机制，为其临床应用提供理论依据，还能为新型直接凝血酶抑制剂的设计提供指导，推动抗血栓药物的研发进程。

1.2重组双功能水蛭素研究现状

重组双功能水蛭素的研发始于对天然水蛭素抗凝机制及结构的深入剖析。天然水蛭素作为凝血酶的特异性抑制剂，从医用水蛭唾液腺提取，由65-66个氨基酸残基组成，是无糖基化单链多肽，分子量约7,000Da。其N端为活性中心区，可插入凝血酶活性中心抑制其活性，且N端3对二硫键对空间构象起稳定作用；C端富含酸性氨基酸，能与凝血酶分子碱性氨基酸富集区域特异性结合，对其抗凝活性至关重要。水蛭素与凝血酶形成1:1非共价可逆复合物，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原能力，抑制纤维蛋白凝固，还能阻断凝血酶催化的止血反应及诱导的血小板反应，极低浓度即可发挥抑制血液凝固功效。

随着对水蛭素构效关系的深入理解，研究人员开始尝试通过基因工程技术对其进行改造。1986年，德国科学家率先采用基因工程技术制备了重组水蛭素，开启了重组水蛭素研究的新纪元。此后，众多科研团队致力于优化重组水蛭素的表达系统和生产工艺，以提高其产量和质量。例如，通过密码子优化、选择合适的表达载体和宿主菌等手段，实现了重组水蛭素在大肠杆菌、毕赤酵母等表达系统中的高效表达。

为进一步拓展水蛭素的功能，研究人员将具有抗血小板聚集功能的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列融合到水蛭素分子的合理部位，构建出重组双功能水蛭素。复旦大学的研究团队通过计算机分子模拟设计新型RGD-Hirudin分子，根据酵母偏爱密码子优化天然水蛭素基因核苷酸序列，融合RGD三肽编码序列后合成目的基因，与毕赤酵母载体pPIC9K质粒重组构建表达质粒，转化毕赤酵母GS115宿主菌，经筛选获得高表达阳性克隆。在摇瓶中实现了高效、稳定和分泌性表达，表达量达0.1g/L。对表达产物的研究表明，r-RGD-Hirudin的空间结构未因RGD三肽序列引入而产生明显变化，抗凝血酶比活性大于10,000ATU/mg，与野生型水蛭素相当，且具有抗血小板聚集功能，终浓度1.5μg/mL时，血小板聚集抑制率为10-20％。放射竞争抑制试验显示其能竞争性抑制纤维蛋白原与血小板结合，半数抑制浓度为0.4pmol/L，与血小板结合亲和力比纤维蛋白原大37倍。利用流式细胞技术研究发现，其对血小板膜GPIlb/IIIa的半数抑制浓度为0.31amol/L，与血小板结合能力比临床常用抗GPllb/IIIa药物硫酸氢氯吡格雷大500倍。

在中试研究方面，采用30LNBS发酵罐对工程酵母菌（RGD-Hirudin-GS115）进行发酵，通过研究溶氧、接种密度、碳源、诱导时密度、诱导时间、甲醇控制等发酵工艺参数，优化发酵条件。经3天发酵，离心取培养液上清，超滤浓缩，凝胶过滤层析，离子交换层析后，得到比活性为12