生化核酸的变性复性与杂交.pptVIP

ABAB限制性内切酶位点与放射性探针结合部位①限制性内切酶酶切后；②电泳分离DNA片段；③转移至硝酸纤维素薄膜；④与放射性探针杂交，⑤分析阳性条带第30页，共51页，星期日，2025年，2月5日由于测序仪在一个泳道只能准确测出几百个核苷酸，对于长DNA,只能将其切成小段再测序，为了组装，需要确定足够多的标记位点。常用遗传图、转录图、物理图、序列标签位点(STS)、表达序列标签(EST)等方法确定标记位点。限制性酶切位点分析是绘制物理图的常用方法第31页，共51页，星期日，2025年，2月5日DNA克隆

应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。由于早期研究是从较大的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(genecloning)。实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。基因工程与蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了——生物技术工程。第32页，共51页，星期日，2025年，2月5日

目的基因应用重组DNA技术是为分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物——蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA(targetDNA)。第33页，共51页，星期日，2025年，2月5日基因载体或称克隆载体(cloningvector)。其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体(expressionvector)。可充当克隆载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA，它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。???质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以质粒在细菌内存在会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对某些抗菌素或重金属的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选转化子细菌的依据。第34页，共51页，星期日，2025年，2月5日ThebasicsofDNAcloning一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并扩增含重组分子的受体细胞。第35页，共51页，星期日，2025年，2月5日DNA克隆的技术路线大致包括以下几个程序：①分离制备待克隆的DNA片段(目的DNA)；②在体外连接目的DNA片段和载体；③重组DNA分子转入宿主细胞；④筛选、鉴定阳性重组子；⑤重组子的扩增。第36页，共51页，星期日，2025年，2月5日(一)DNA限制酶与连接酶类型Ⅰ限制酶为多亚基双功能酶，S亚基为识别亚基，识别位点为两部分序列，中间有一定长度的任意碱基对，M亚基有甲基化酶活性，R亚基为切割亚基，可在识别位点1kb以上处随机切割。类型Ⅱ限制酶有两个相同的亚基组成，识别位点为4~6bp的回文序列，切割位点在识别位点内，或靠近识别位点，经切割可以生成平头末端或粘性末端，可以产生相同粘性末端的不同的限制酶称作同尾酶。类型Ⅱ限制酶是分子生物学中最重要的工具酶。类型Ⅲ限制酶为两个亚基的双功能酶，M亚基为识别亚基，R亚基为切割亚基，切割位点在识别位点下游24~26bp处，特异性不强。EcoRI与DNA的复合体第37页，共51页，星期日，2025年，2月5日第38页，共51页，星期日，2025年，2月5日限制性内切酶切割DNA形成对应的粘性末端外源DNA可以被插入质粒载体第39页，共51页，星期日，2025年，2月5日第1页，共51页，星期日，2025年，2月5日8.8.1变性与复性增色效应减色效应第2页，共51页，星期日，2025年，2月5日8.8.2杂交核酸分子杂交是研究核酸结构与功能的最基本的分子生物学技术之一,即采用带有某种标记的核酸单链作为探针,在一定条件下,按照碱基互补原则与同源的核酸单链退火形成双链杂交体,从而鉴定靶序列的存在与否及其分子大小第3页，共51页，星期日，2025年，2月5日***分子杂交分类***?SouthernBlot----DN