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基因操作的相關技術工具酶及其應用第一節：限制性內切酶限制性內切酶是一類專門切割DNA的核酸內切酶分類?類與???類酶因其識別與切割位點不在同一部位，且切割產物無特異性，所以在分子克隆中不常用。重組DNA技術中常用的限制性內切酶為Ⅱ類酶。大部分Ⅱ類酶識別DNA位點的核苷酸序列呈二元旋轉對稱，通常稱這種特殊的結構順序為回文結構(palindrome)。例如

????????5′-G▼AATTC-3′

????????3′-CTTAA▲G-5′

為EcoRⅠ識別序列，其中黑三角所指便是EcoRⅠ的切割位點。

限制性內切酶的命名方法：限制性內切酶的識別特點1、大多數識別序列是很嚴格的，只有少數的有變動的餘地。2、識別序列的堿基數一般為4-6個堿基對3、大多數識別位點具有180度旋轉對稱性。切割方式

一、識別序列不同，切割方式也不同二、識別序列不同，切割產生的粘末端相同（同尾酶）三、識別序列相同，切割方式不同四、識別序列相同，切割方式也相同限制酶末端的連接匹配末端平端不匹配末端Klenow酶：該酶無5-3外切活性，保留了5-3聚合活性及3-5外切活性，基因工程中利用該酶：修復限制性內切酶造成的5突出的粘性末端限制性內切酶的酶切條件限制性內切酶發揮最大活性的最適條件：PH值：7.4反應溫度：37℃適當的離子強度(由NaCl提供)和鎂離子(Mg2+)濃度加還原劑(DTT)限制性內切酶的滅活70℃保存20分鐘，滅活限制性酶苯酚抽提，除去限制性酶加入EDTA鼇和鎂離子，阻止限制性酶的作用DNA聚合酶（一）大腸桿菌DNA聚合酶I

5’-3’聚合酶活性

3’-5’外切酶活性

5’-3’外切酶活性

核酸內切酶活性

TaqDNA聚合酶：

耐高溫，主要用於PCR反應，最適反應溫度為75~80度。T4-DNA連接酶（T4-DNALigase）來源於T4噬菌體感染的大腸桿菌，連接修復3‘端羥基和5’端磷酸基因，脫水形成3‘-5’磷酸二酯鍵連接雙鏈DNA上的單鏈缺口（Nick）亦可連接限制內切酶所產生的粘性末端

連接酶鹼性磷酸酯酶第二章:

基因工程載體質粒：質粒是染色體外能夠進行自主複製的遺傳單位，絕大多數的細菌質粒都是共價閉合環狀DNA分子(covalentlyclosedcircular,CCCDNA)。按照複製性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體複製一次時，質粒也複製一次，每個細胞內只有1～2個質粒；另一類是鬆弛型質粒，當染色體複製停止後仍然能繼續複製，每一個細胞內一般有20個左右質粒。質粒DNA的構型超螺旋DNA(supercoliedDNA，SCDNA)鬆弛開環的DNA（opencircles,OCDNA）鬆弛線形的DNA(LinearDNA)