动物细胞培养的基本方法.pptxVIP

第五节动物细胞培养的基本方法一细胞分离1离心分离法用于从含有细胞的体液如血液、羊水、胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm离心5～10min。

2消化分离法先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

细胞计数血球计数板计数自动细胞计数器计数结晶紫染色细胞核计数法MTT染色计数法

细胞传代1悬浮细胞的传代加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或多只培养瓶即可。

2贴壁细胞的传代消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细胞有无污染；加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度；消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min,当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养基。

已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次。2倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。分种数量取决于细胞数和细胞特性，多数细胞分种以20～30万个/ml,每次1传2或1传3。传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天就要传代一次。

四细胞的冻存和复苏1细胞的冻存将细胞放入试管内，在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂（二甲基亚砜+山梨醇+甘油+蔗糖）。密封试管，继续在冰浴中停留15min。然后试管以1℃/min的速度冷却，降到-40℃，在-40℃停留2h后投入液氮罐（-196℃）。

2细胞的复苏复温速率复温速率是指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复苏速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。

第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式

动物细胞大规模培养：在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，贴壁依赖)等。

已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

依细胞种类：原代培养、传代培养依培养基：液体培养、固体培养依培养器和方式:静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养。生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

一、动物细胞大规模培养的方法悬浮培养（suspensionculture）让细胞自由的悬浮于培养基内进行生长繁殖。适用细胞类型：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤设备：通气搅拌式生物反应器、气升式生物反应器。生产药物：单克隆抗体；干扰素。

优点：操作简单，培养条件均一，传质和传氧效果好，容易大规模培养。借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采用灌流培养，细胞密度低。

2、贴壁培养基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具有一定电荷密度。适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞。必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。

优点：a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面，可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。

b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。

c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效的表达一种产品。

缺点：a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积。b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。c不能有效地监控细胞的生长。贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载体培养。

贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。PARTONE

3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。

理想的微载体应具备：生物相容性；无毒性；表面惰性；比重适当（）；粒径均一，在60-250?m之间（溶胀后）；光学透明；柔软；耐高压灭菌温度；反复多次使用；制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或多孔微球，增大了供细胞贴附的比表面积。应用：工业化生产干扰素、疫苗和尿激酶原

包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。可用于包埋细胞的载体材料为：人工合成的高分子聚合物；糖类如纤维素等；蛋白质如胶原、纤维蛋白等。

包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化