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解析两种猪腹泻冠状病毒：基因组克隆与载体构建关键技术及应用

一、引言

1.1研究背景与意义

在现代畜牧业中，养猪业占据着重要地位，是保障肉类供应和农业经济发展的关键产业之一。然而，猪腹泻冠状病毒的肆虐给全球养猪业带来了沉重打击。猪腹泻冠状病毒主要包括猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus，PDCoV）等，这些病毒具有高度传染性，能在猪群中迅速传播，引发严重的肠道疾病。

PEDV自20世纪70年代在欧洲首次被发现以来，已在全球范围内广泛传播。尤其是在亚洲和美洲地区，PEDV多次引发大规模的猪腹泻疫情。据统计，2013-2014年，美国因PEDV疫情导致约700万头仔猪死亡，经济损失高达数十亿美元。在我国，PEDV也是猪场中常见的病原体，每年都会造成大量仔猪发病和死亡，给养猪业带来巨大的经济损失。其主要感染途径为粪-口传播，病毒通过污染的饲料、饮水、器具等进入猪体，在肠道上皮细胞内大量复制，破坏肠道黏膜屏障，导致仔猪出现呕吐、水样腹泻、脱水等症状，严重时可导致仔猪因脱水和电解质紊乱而死亡，1周龄内仔猪死亡率可达90%-100%。

PDCoV是一种新型猪冠状病毒，2012年在香港首次被报道，随后在美洲、亚洲等多个养猪国家和地区相继出现。2014年初，美国俄亥俄州的仔猪腹泻病料中检测到PDCoV，随后在加拿大、韩国、越南、老挝等国家也有报道，其阳性检出率高达25％。2015年，我国华东地区猪场也检测到该病毒，表明PDCoV已在中国大陆猪群中存在。PDCoV主要引起哺乳仔猪的呕吐、腹泻和死亡等症状，虽然其致病力相对PEDV较低，但由于其传播范围广，也给养猪业带来了不容忽视的经济损失。临床上，PDCoV感染后，仔猪通常在20-48小时内出现腹泻症状，持续约1周，同时伴有呕吐、脱水、厌食和生长迟缓等症状，新生仔猪感染后的死亡率最高，接近100%。

猪腹泻冠状病毒不仅直接导致猪只的发病和死亡，增加养殖成本，还会影响猪的生长性能和繁殖性能。患病猪生长速度减缓，饲料转化率降低，育肥猪体重下降，母猪可能出现流产、早产、产弱仔等情况，严重影响猪场的经济效益和可持续发展。此外，为了防控疫情，养殖场需要投入大量的人力、物力和财力用于疫苗接种、生物安全措施和疫病监测等，进一步加重了养殖成本。

为了有效防控猪腹泻冠状病毒，深入了解其致病机制、开发有效的疫苗和药物至关重要。而基因组克隆及载体构建是开展这些研究的基础。通过基因组克隆，可以获得病毒完整的基因组序列，从而深入研究病毒的基因结构、功能和进化关系。载体构建则可以将病毒基因组导入合适的宿主细胞中，实现病毒的拯救和增殖，为研究病毒的致病机制、筛选抗病毒药物和开发疫苗提供重要的工具和平台。例如，通过对PEDV基因组的克隆和分析，发现其S蛋白基因的变异与病毒的毒力和免疫原性密切相关，这为开发新型疫苗提供了理论依据。利用构建的载体系统，可以在细胞水平上研究病毒与宿主细胞的相互作用，筛选出具有抗病毒活性的化合物，为开发抗猪腹泻冠状病毒药物奠定基础。因此，开展两种猪腹泻冠状病毒基因组克隆及载体构建研究具有重要的理论意义和实际应用价值，对于推动养猪业的健康发展具有重要作用。

1.2猪腹泻冠状病毒概述

猪腹泻冠状病毒是一类对养猪业危害严重的病毒，其中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）是最为常见且危害较大的两种。

PEDV属于α冠状病毒属，是一种具有囊膜的单股正链RNA病毒。其病毒粒子呈球形，直径约130-140nm，表面有花瓣状纤突。PEDV基因组全长约28kb，包含7个开放阅读框（ORF），分别编码RNA聚合酶、刺突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）以及一些辅助蛋白。S蛋白在病毒感染过程中起着关键作用，它能够识别并结合宿主细胞表面的受体，介导病毒与细胞的融合，从而使病毒进入细胞内。S蛋白也是诱导机体产生中和抗体的主要抗原，其变异会影响病毒的免疫原性和致病性。

PEDV主要感染猪，各种年龄的猪均易感，但以仔猪尤其是1周龄内的新生仔猪最为敏感，发病率和死亡率极高。仔猪感染PEDV后，通常在1-2天内出现症状，主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水等。粪便呈黄色、灰色或绿色水样，常含有未消化的凝乳块，气味恶臭。由于严重的腹泻和呕吐，仔猪会迅速脱水，体重下降，皮肤干燥、弹性降低，眼球下陷。若不及时治疗，1周龄内仔猪死亡率可达90%-100%。育肥猪感染后，主要症状为腹泻，粪便呈水样或糊状，颜色较深，食欲明显减