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荧光染料的选择及数据分析张新梅FromBDBiosciences

荧光染料的选择

什么是流式细胞仪在流动的状态中检测颗粒性物质各种物理及生物特征的一种仪器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid

流式细胞仪原理检测信号散射光信号前向散射光信号(FSC)侧向散射光信号(SSC)荧光信号

流式细胞仪原理散射光信号当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散色光信号（SSC）。

FSC反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强；02可用于表示细胞的凋亡；04前向角散射光信号（FSC）01FSC信号与细胞的折射率有关；03区分死/活细胞时，可用于设门；05流式细胞仪原理

流式细胞仪原理侧向角散射光信号（SSC）SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强；

流式细胞仪原理FSC和SSC信号用于检测并显示细胞的物理学特征中性粒细胞单核细胞淋巴细胞SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000

流式细胞仪原理荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。

流式细胞仪原理

流式细胞仪原理

01特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；02可检测的样本种类多样03外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞04New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液流式细胞仪特点及检测标本

多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的发现及抗体标记物的发展01但抗体组合选择非常复杂，如果随意选择荧光素搭配的抗体，不可能得到合适的结果。02在荧光染料的选择上多一点考虑，就可避免重复实验和错误的结果。03荧光染料选择的必要性

流式细胞仪原理荧光信号1激发波长3发射波长2荧光素

了解你的仪器

试剂的选择从了解你的仪器的配置开始01激光（激发光源）：是否可以激发待选的荧光素02检测器：是否有足够的检测器来检测所要用的荧光抗体组合03光路设计：影响特别染料的检测效率04滤片：宽滤片提高检测能力，但也会检测到更多干扰光05基本要求-了解你的仪器

荧光染料488nm激光激发的染料

荧光染料595nmand633nmEXCITEDDYES(APC)633nm激光激发的染料

荧光染料UV激光激发的染料

荧光染料常见荧光染料的发射波长

了解荧光素的性质

了解荧光素的相对荧光强度荧光素/单抗结合物的亮度每种荧光素的相对荧光强度不同CascadeBlueAPC-Cy7FITCPE-Cy7TexasRedPEPE-Cy5AP280.951.01.42.84.66.29.2RelativeBrightnessPositive/negativePositive/autofluorescenceCD8fluorescenceofCD3+cellsData:Dr.MarioRoederer,StanfordUniv..

了解荧光素的相对荧光强度各种荧光素在BDLSRII流式细胞仪上的染色指数

了解荧光素的相对荧光强度每种荧光素的相对荧光强度不同对一个既定的单抗来讲，因为结合的荧光素不同，阳性/阴性细胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascadeBlue110100110100FluorescenceIntensityRelativeNumberofCells110100110100Data:Dr.MarioRoederer;StanfordUniversityNegControlPositive(CD8-X)

了解荧光素的相对荧光强度1000每种荧光素的相对荧光强度不同不同仪器的激光及滤片组合不同，荧光素的相对荧光强度也不同011101000111010001110100FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927/P比值FITC和PerCP的结合物通常一个抗体分子上结合几个（2-9个，依抗体而定）荧光素分子。APC和PE与抗体结合一般是1：1。05与之相反的是，复合染料PerCP-CY5.5，PerCP与CY5.