现代分子生物学与环境科学 (2).pptVIP

三.分子生物学研究方法*DNA探针的Southern杂交DNA探针的Southern杂交的主要技术骤：a.琼脂糖凝胶分离DNA样品；b.DNA的转膜(Southern印迹、虹吸印迹法)；c.预杂交；d.DIG(地高辛生物素)标记的DNA探针与靶DNA杂交。*RNA探针的Northern杂交该技术与DNA探针的Southern杂交的主要步骤是一致的。第63页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法*核酸原位杂交核酸原位杂交(nucleicacidhybridizationinsitu):以特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，并对其进行检测的方法。由于特异性高，并可精确定位，因此该技术广泛应用与医学研究，并已经开始应用于环境科学研究(见第三部分)。第64页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法根据其所用探针及所要检测核酸的不同，核酸原位杂交可分为DNA/DNA、RNA/DNA和RNA/RNA杂交。核酸原位杂交的基本步骤:细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗和放射自显影(或免疫酶法显色或荧光检测)显示杂交结果。第65页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法基因芯片技术基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交一致，即应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在一微小的基片表面集成大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。基因芯片主要技术流程包括:芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。第66页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法(3)细菌转化细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。(4)核苷酸序列分析*Sanger双脱氧链终止法；*Maxam-Gilbert化学修饰法；*DNA杂交测序法(SBH)。第67页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法基因操作过程核苷酸测序原始图象第68页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法(5)基因扩增聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)是1983年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明的具有划时代意义的聚合酶链反应，最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，TaqDNA多聚酶(TaqDNApolymerase)的分离使PCR技术得以广泛应用。第69页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法PCR技术是当今分子生物学领域种类最多、发展最快、应用最为广泛的技术之一，现在已经有多达20种常用的PCR技术，而且随着研究的深入，还将不断有新的PCR方法出现。在所有的PCR方法中，引物的设计始终是其关键。引物设计的好坏决定了反应的特异性和扩增的效率，因此，引物设计一般采用商业化软件进行，根据已有的核酸序列数据库进行筛选。第70页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法Bio－Rad荧光定量PCR仪ABI7000荧光定量PCR仪第71页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法3.基因的分离与鉴定基因的分离和鉴定实际上就是我们通常所说的基因克隆的两个主要内容，包括以下四个基本步骤:(1)用于基因克隆的DNA材料的选择以及DNA子的片段化；(2)外源DNA片段与载体分子的体外连接反应；(3)人工重组的DNA分子导入它们能进行正常复制的宿主细胞；(4)重组体分子的转化子克隆的选择或筛选。第72页，共111页，星期日，2025年，2月5日三.分子生物学研究方法4.基因克隆的主要载体系统(1)质粒(plasmid)DNA载体系统；