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癌基因pim-3的克隆及其对肝癌细胞凋亡的调控机制研究

一、引言

1.1研究背景与意义

肝癌是全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。据统计，肝癌在我国的发病率位居恶性肿瘤前列，每年新增病例数众多，严重影响患者的生活质量和生命健康。早期肝癌患者通过手术切除、肝移植等治疗手段，部分可以获得较好的疗效，但大多数肝癌患者在确诊时已处于中晚期，失去了手术治疗的机会，且对放化疗的敏感性较低，预后较差，5年生存率极低。因此，深入研究肝癌的发病机制，寻找新的治疗靶点和治疗方法，对于提高肝癌患者的生存率和生活质量具有重要意义。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，在维持机体正常生理功能和内环境稳定中发挥着重要作用。正常情况下，细胞凋亡与细胞增殖处于动态平衡状态，当这种平衡被打破，细胞凋亡受到抑制，细胞增殖异常活跃，就可能导致肿瘤的发生发展。在肝癌的发生发展过程中，细胞凋亡异常起着关键作用，许多癌基因和抑癌基因参与了细胞凋亡的调控。因此，研究肝癌细胞凋亡的调控机制，寻找能够诱导肝癌细胞凋亡的分子靶点，为肝癌的治疗提供了新的思路和策略。

Pim-3基因是Pim激酶家族的重要成员，属于原癌基因。Pim激酶家族包括Pim-1、Pim-2和Pim-3，它们在结构和功能上具有相似性，均编码丝/苏氨酸蛋白激酶。Pim-3基因在多种肿瘤组织中高表达，如肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌等，而在正常组织中表达较低或不表达。研究表明，Pim-3基因通过磷酸化众多特异性底物，在细胞增殖、凋亡、细胞周期进程等生物学过程中发挥重要调控作用。在肿瘤细胞中，Pim-3基因的高表达可以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力，与肿瘤的发生发展及不良预后密切相关。因此，Pim-3基因有望成为肿瘤治疗的新靶点。

在肝癌中，Pim-3基因的异常表达已被证实，但其具体的作用机制尚未完全明确。深入研究Pim-3基因在肝癌细胞凋亡中的作用及机制，对于揭示肝癌的发病机制，开发新的肝癌治疗方法具有重要的理论和实际意义。通过克隆Pim-3基因，构建其表达载体，并将其转染到肝癌细胞中，观察其对肝癌细胞凋亡的影响，进一步探讨其作用机制，为肝癌的基因治疗提供实验依据和理论支持，有望为肝癌患者带来新的治疗希望，改善肝癌患者的预后。

1.2pim-3基因概述

Pim-3基因是莫罗尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点（provirusintegrationsiteformoloneymurineleukemiavirus，Pim）蛋白家族成员，属于原癌基因，编码丝/苏氨酸蛋白激酶。在人类中，Pim-3基因定位于染色体22q13，全长35.6kb，其逆转录产物（cDNA）由2392bp组成，编码包含326个氨基酸序列的开放读码框。在蛋白质水平上，人Pim-3与大鼠或小鼠的序列相似性高达95%，在激酶结构上与鼠和兔的序列相似性亦达95%，这表明Pim-3在进化过程中具有高度的保守性。

Pim-3蛋白主要通过磷酸化众多特异性底物，参与细胞内多种信号转导通路，进而在细胞增殖、凋亡、细胞周期进程等生物学过程中发挥关键调控作用。在细胞增殖方面，Pim-3可以通过激活某些转录因子或信号通路，促进细胞从G1期进入S期，加快细胞的增殖速度。例如，Pim-3能通过激活PGC-1α而加强c-MycmRNA的表达，从而促进肿瘤细胞的生长，c-Myc是一种重要的原癌基因，参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程，Pim-3对c-Myc的调节作用进一步说明了其在细胞增殖调控中的重要性。

在细胞凋亡调控中，Pim-3扮演着抑制细胞凋亡的角色。研究发现，Pim-3能直接磷酸化Bad上的Ser112位点，使Bad灭活，从而抑制肿瘤细胞凋亡。Bad是一种促凋亡蛋白，正常情况下，它可以与抗凋亡蛋白Bcl-XL或Bcl-2结合，形成异二聚体，促进细胞凋亡。而Pim-3对Bad的磷酸化修饰，使得Bad与14-3-3蛋白结合，无法再与Bcl-XL或Bcl-2相互作用，从而阻断了凋亡信号的传递，抑制细胞凋亡，维持细胞的存活。

Pim-3在多种肿瘤的发生发展过程中扮演着关键角色。在肝癌中，研究人员通过转基因技术制作的小鼠感染HBV后肝肿瘤形成的模型中，发现Pim-3mRNA只会选择性地表达于人体肝肿瘤细胞中，在正常的肝组织中则无表达。当利用RNA干扰技术使Pim-3基因丧失后，肝细胞肿瘤中的细胞增殖