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甘薯叶多酚氧化酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

一、引言

多酚氧化酶（PolyphenolOxidase，PPO）是一类广泛存在于植物、动物和微生物中的氧化酶，在植物的生长发育、抗病防御以及果实的褐变过程中发挥着重要作用。甘薯作为一种重要的粮食和经济作物，其叶片中含有丰富的多酚氧化酶。对甘薯叶多酚氧化酶进行分离纯化及性质研究，有助于深入了解该酶的作用机制，为甘薯的品种改良、贮藏保鲜以及相关产品的开发提供理论依据。本研究旨在建立甘薯叶多酚氧化酶的高效分离纯化方法，并对其部分性质和功能基团进行系统研究。

二、材料与方法

（一）材料与试剂

新鲜的甘薯叶片采自本地种植基地，选择生长健壮、无病虫害的植株。主要试剂包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸铵、SephadexG-100、DEAE-纤维素、考马斯亮蓝G-250等，均为分析纯或生化试剂。

（二）仪器与设备

高速冷冻离心机、紫外-可见分光光度计、层析柱、恒流泵、核酸蛋白检测仪、pH计等。

（三）实验方法

1.酶的提取

将新鲜的甘薯叶片洗净，沥干水分，剪碎后放入预冷的研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH6.8），在冰浴条件下研磨成匀浆。将匀浆转移至离心管中，于4℃下以12000×g离心20分钟，收集上清液，即为粗酶液。

2.分离纯化

（1）硫酸铵沉淀

向粗酶液中缓慢加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到40%，搅拌均匀后，在4℃下静置1小时。然后于4℃下以12000×g离心20分钟，弃去沉淀。向上清液中继续加入硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度达到80%，同样在4℃下静置1小时后离心，收集沉淀。将沉淀用少量磷酸缓冲液（pH6.8）溶解，并用透析袋在4℃下对相同缓冲液透析24小时，期间更换缓冲液3-4次，得到初步纯化的酶液。

（2）DEAE-纤维素离子交换层析

将DEAE-纤维素用磷酸缓冲液（pH6.8）平衡后，装入层析柱中。将初步纯化的酶液上样，然后用含0-0.5mol/LNaCl的磷酸缓冲液（pH6.8）进行线性梯度洗脱，流速为1.0mL/min，收集洗脱液，每管5mL。通过测定各管洗脱液的酶活性和蛋白含量，合并酶活性高的部分。

（3）SephadexG-100凝胶过滤层析

将SephadexG-100凝胶用磷酸缓冲液（pH6.8）充分溶胀后，装入层析柱中。将经DEAE-纤维素层析纯化的酶液上样，用相同缓冲液进行洗脱，流速为0.5mL/min，收集洗脱液，每管3mL。同样通过测定酶活性和蛋白含量，合并酶活性高的部分，得到纯化的甘薯叶多酚氧化酶。

3.酶活性测定

采用邻苯二酚法测定酶活性。反应体系包括50mmol/L磷酸缓冲液（pH6.8）2.8mL，0.1mol/L邻苯二酚溶液0.1mL，酶液0.1mL。于30℃恒温水浴中反应3分钟，在420nm波长处测定吸光度的变化。定义每分钟吸光度增加0.01为一个酶活性单位（U）。

4.蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，以牛血清白蛋白为标准品，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品中的蛋白含量。

5.部分性质研究

（1）最适pH值测定

在不同pH值的磷酸缓冲液（pH5.0-8.0）中，按照上述酶活性测定方法，测定酶的活性，确定酶的最适pH值。

（2）最适温度测定

在30-80℃的温度范围内，以最适pH值的缓冲液进行酶活性测定，确定酶的最适温度。

（3）热稳定性测定

将酶液分别在不同温度（40-80℃）下保温30分钟，然后迅速冷却至室温，测定其剩余酶活性，以未保温的酶液活性为100%，计算剩余酶活性的百分比，研究酶的热稳定性。

6.功能基团研究

（1）化学修饰剂对酶活性的影响

分别选取几种常见的化学修饰剂，如N-乙基马来酰亚胺（NEM，巯基修饰剂）、苯甲基磺酰氟（PMSF，丝氨酸残基修饰剂）、二硫苏糖醇（DTT，二硫键还原剂）、碘乙酸（IA，巯基修饰剂）等。将酶液与不同浓度的修饰剂在30℃下孵育30分钟，然后测定酶活性，以不加修饰剂的酶液活性为100%，计算酶活性的抑制率，分析各功能基团对酶活性的影响。

（2）金属离子对酶活性的影响

在酶反应体系中加入不同浓度的金属离子，如Cu2?、Fe3?、Zn2?、Mg2?、Ca2?等，测定酶活性的变化，研究金属离子对酶活性的影响。

三、结果与分析

（一）分离纯化结果

通过硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和SephadexG-100凝胶过滤层析三步纯化方法，成功从甘薯叶中分离纯化得到多酚氧化酶。纯化过程中各步的酶活性和纯化倍数如表1所示。

纯化步骤

总蛋白（mg）

总活性（U）

比活性（U/mg）