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园林小菊黑斑病菌菌丝悬浮液接种体系优化和抗病种质筛选

中图分类号：S436.8+1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2025）11-0099-06

菊花（Chrysanthemummorifolium）为菊科菊属多年生宿根花卉，世界四大切花之一，具有较高的观赏价值和药用价值[1-2]。园林小菊为菊花中的一类小花型品种类群，其植株分枝多而着花繁密，花朵色彩艳丽，广泛应用于盆栽、园林造景和大地艺术[3]。由链格孢菌（Alternariaalternata）侵染引起的黑斑病是园林小菊生产中最常见的病害，在整个生长期均可发生，在适温（25～27°C）、高湿环境中发病更为严重，每年7、8月是黑斑病发病的高峰期[4-5]。发病时叶片出现黑褐色斑点，外围有黄色晕圈，一般从植株下部叶片开始，然后向上蔓延，严重时导致整株叶片发病[6]。研究表明，菊花黑斑病可通过带病落叶、土壤及脚芽传播，传播范围极广[7]。目前进行抗病性育种是防治园林小菊黑斑病最根源、最有效的手段。

建立精准快速鉴定黑斑病抗性的技术体系以筛选出抗病亲本材料是园林小菊黑斑病抗性育种的关键。在其他作物上已有相关病害抗性鉴定技术体系的研究。张彪等研究发现，在28°C，12h-12h光一暗交替的条件下，用灰斑病菌（Cercosporasojina）菌丝块接种抗感大豆的离体叶片，菌斑面积明显不同[8]。常有宏等在对梨黑斑病接种方法的研究中发现，用孢子悬浮液或菌丝液涂抹在叶面上的接种方法相比于菌丝块接种的发病时间更早，且发病症状更明显[9]。臧宪朋等将核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）菌丝悬浮液的浓度调至吸光度D600nm为1.0～2.0，用空压机喷雾接种到油菜植株，每株接种约2.5mL，保湿48h，研究结果显示该方法适用于油菜苗期菌核病的抗病性评价[10]

目前，关于菊花黑斑病的研究主要集中在抗性品种筛选、鉴定方法、防治方法等方面[11-14]，然而其抗性鉴定评价体系尚不健全。本研究采用链格孢菌（Alternariaalternata）菌丝悬浮液接种的方法，对不同菌株的致病力进行鉴定，利用最佳菌株进行不同接种用量和接种方法的试验比较，并引用黑斑病抗病模型把人工接种鉴定结果与田间病害调查结果相结合，对现有的11份园林小菊种质进行抗病性评价，以期优化建立园林小菊苗期黑斑病快速、准确鉴定的菌丝接种体系，为菊花抗病种质筛选提供技术支撑。

1材料与方法

1.1供试材料

试验于2022年6—10月在南京农业大学白马教学科研基地进行。供试的链格孢菌（Alternariaalternata）菌株CJ31、CJ37、CJ3、F20，均由南京农业大学菊花遗传育种实验室从滁菊和福白菊黑斑病病株中分离并保存。供试的11份园林小菊种质（灵峰白、灵峰黄、灵峰锦、灵岩淡黄、灵岩鲑、灵溪橙、溱湖白、金陵红荷、钟山楚薇、钟山奶黄、钟山文秀）来源于中国菊花种质资源保存中心。

1.2病原菌活化及菌丝悬浮液制备

将菌株接种至PDA培养基活化，28°C培养7d后用灭菌打孔器沿PDA培养基边缘打取直径为

5mm大小的36枚菌块置于200mLPDB培养基中，在28°C摇床上以200r/min振荡培养24h。在超净工作台内用前端剪口的蓝枪头将菌球吸出，放进1.5mL离心管中。每个离心管放2个菌球和1个钢珠，将菌球全部装入离心管中后置于高通量组织研磨仪内，50Hz?120s振碎菌丝。研磨后，将菌丝匀浆全部倒人500mLPDB培养基中，在28°C摇床上以200r/min继续振荡培养48h，制成菌丝悬浮液，浓度调至吸光度D600nm=1.0备用。

1.3黑斑病菌菌丝悬浮液接种抗性鉴定方法的建立

1.3.1不同菌株的致病力比较以苗龄33d左右的灵溪橙离体叶片为接种对象，采集植株顶部向下第2～3张完全展开并且无病虫害和损伤的成熟叶片。采集的叶片首先用75%乙醇冲洗10s，随后用无菌水冲洗3遍，每遍3s，用无菌滤纸擦干表面水分，叶柄处包裹上1层蘸有无菌水的湿润灭菌脱脂棉。在外径90mm的无菌圆形培养皿中平铺放入无菌滤纸，加入15mL无菌水。随后将处理好的叶片放入培养皿中，避开叶片主脉用2mL注射器针头在叶片同一位置轻轻扎3～5个小孔，创伤面积尽量保持一致。在接种过程中，每次吸取菌丝悬浮液前先轻轻摇晃，保证均匀性，随后吸取2mL菌丝悬浮液置于滤纸上过滤，用镊子或毛笔将菌丝聚集成团，避开叶脉涂抹于离体叶片背面刺伤处，同时在对照叶片背面刺伤处均匀涂布等量的无菌水。在28°C、相对湿度70%～80%、12h—12h光—暗交替的光照培养箱中培养，7d后观察发病情况并拍照记录。每个处理接种10张叶片，重