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昆虫系统表达-大分子蛋白/跨膜蛋白表达

重组蛋白的高效表达是现代生物技术、结构生物学以及生物制药产业的核心环节。常见的蛋白表达系统包括原核细菌、大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞。大肠杆菌表达速度快、成本低，但缺乏复杂的翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTMs)；酵母能完成部分修饰，但糖基化模式与人类差异较大；哺乳动物细胞系统修饰最接近天然环境，但建立稳定细胞株耗时长，且生产成本较高。相比之下，昆虫细胞表达系统，尤其是基于杆状病毒(baculovirus)的表达系统(BaculovirusExpressionVectorSystem,BEVS)，在表达效率、翻译后修饰和成本之间取得了较好平衡，因此成为表达大分子蛋白和跨膜蛋白的重要平台。

昆虫细胞表达系统概述

1.常用细胞株

最常见的昆虫细胞包括来源于玉米夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9和Sf21，以及来自斜纹夜蛾(Trichoplusiani)的HighFive?(BTI-Tn-5B1-4)细胞。Sf9与Sf21常用于杆状病毒扩增与蛋白表达，而HighFive细胞在表达分泌型蛋白方面具有更高效率，已被广泛应用于疫苗生产。

BEVS系统特点

BEVS依赖杆状病毒感染昆虫细胞。其优点是：

①．启动子强，表达量高；

②．可表达多亚基复合体与病毒样颗粒(VLP)；

③．能进行真核特有的PTMs，如糖基化、磷酸化。

不足之处在于：构建重组病毒流程较复杂，感染后细胞寿命有限，且部分糖基化模式与人类差异明显。

无病毒瞬时表达(virus-freeTGE)

除BEVS外，近年来发展出基于质粒瞬时转染的表达策略，即virus-freetransientgeneexpression(TGE)。该方法不依赖病毒扩增，缩短了生产周期，避免了病毒带来的安全与纯化难题。研究表明，TGE在膜蛋白和抗体表达方面展现了良好的应用前景。

大分子蛋白表达策略

1.翻译后修饰能力

昆虫细胞具备诸如磷酸化、N-糖基化、泛素化、乙酰化等PTMs能力，虽与哺乳动物系统稍有差异，但通过基因工程改造可接近人类glycosylation模式。如利用AdaptiveLaboratoryEvolution(ALE)和其他技术，可增强PTM功能与表达产率。

2.VLP与复杂蛋白表达

BEVS适合表达VLP和多峋复合体，常见策略包括Bac-to-Bac系统、多病毒共感染（MultiBac）、稳定细胞株构建等。virus-free系统也能表达VLP，如通过共转染多基因质粒并建立稳定细胞株。

3.提升表达效率的方法

--抗凋亡基因（如P35、vankyrin）用于延长感染后细胞寿命，提高蛋白产量。

--RNA干扰沉默促凋亡基因，如TSC1或caspase，可推动表达效率。

--改进启动子（如polh或p10）、采用FACS/qPCR快速滴度法、有助缩短BEVS生产周期。

--高密度培养与ALE策略也可提升整体产量与稳定性。

跨膜蛋白表达的挑战与解决方案

1.跨膜蛋白表达难点

跨膜蛋白具有疏水α-螺旋结构、不稳定且表达水平通常低，不易正确折叠与纯化。BEVS在感染晚期可能导致细胞膜结构破坏，影响跨膜蛋白表达。

2.昆虫TGE的优势

最新研究表明，HighFive细胞通过无病毒瞬时转染结合优化的溶出剂(如DDM/CHS)与纯化标签(如Twin-Strep)，能够获得均一性和稳定性更高的膜蛋白。这一方法在成本和效率上均优于哺乳动物系统，特别适合结构生物学研究。

昆虫细胞表达的优化策略与未来发展方向

优化载体设计

--采用强启动子或双启动子系统提升表达量；

--加入信号肽促进分泌；

--融合可切除标签以便纯化。

细胞株工程化

--表达人源糖基转移酶，实现类人糖基化；

--利用CRISPR/Cas编辑凋亡相关基因，提高细胞存活率；

--引入伴侣蛋白，增强折叠效率。

工艺优化

--高密度悬浮培养结合分批补料；

--精准控制溶氧和pH，减少应激；

--应用一次性生物反应器，提升工业化可扩展性。

跨膜蛋白特化方案

--表达伴侣蛋白帮助嵌入膜环境；

--结合脂质纳米颗粒或纳米抗体稳定膜蛋白结构；

--利用改良去垢剂减少蛋白聚集。

未来发展方向

--合成生物学赋能，实现模块化和可编程的蛋白生产；

--自动化与连续化生产，缩短研发周期；

--跨平台组合表达，根据不同蛋白需求选择昆虫、哺乳或细菌系统的最优组合。

实际应用案例

疫苗制备：Nuvaxovid/Covovax