核酸分子杂交技术.pptVIP

分子生物学检测技术;核酸分子杂交技术

一、核酸分子杂交的定义及基本原理

;核酸分子杂交的基本原理;变性;二、核酸分子杂交的探针;2、标记物

3、标记的方式;DNA探针

;DNA探针;DNA探针的主要优点;cDNA探针;RNA探针;寡核苷酸探针;;;（3）标记物种类

;（3）标记方法

体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中

;;酶促标记法

切口平移法（nicktranslation);随机引物法;随机引物法所具有的优点：

1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记

2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题

3、标记活性高，标记活性可达108cpm/μgDNA以上

4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记;PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反

应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中;（三）探针的纯化

1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质

2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-50

3、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针;二、影响杂交的因素

1、核酸分子的浓度和长度：

浓度越大，复性速度越快

分子越大，复性速度越慢

单链探针，浓度增加，杂交效率增加

双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂

交效率;2、温度：

（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低

Tm值

（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃;3、离子强度：

（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加

（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度

;4、甲酰胺：

（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42℃杂交

（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交

;5、核酸分子的复杂性：

（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度

（2）Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比

（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性;6、非特异性杂交反应：

（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附

（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉

;三、核酸分子杂交的方法

按待测核酸是否固定在固相支持物上分：

固-液相杂交

膜上印迹杂交

原位杂交

液相杂交

RNA酶保护分析法

核酸酶S1保护分析法

;带有DNA片段的凝胶;（一）Southern印迹杂交

1、待测核酸样品的制备

（1）裂解或破碎细胞

（2）抽取纯化基因组DNA

（3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段;2、待测DNA样品的电泳分离

（1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶

分离小片段用高浓度胶

（2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子

DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，

大小相同的分子处于同一条带

（3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂所用分子量标准可用核素标记;3、凝胶中核酸的变性（碱变化）

凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的

单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲