TCALAS96—2020实验动物螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法.docxVIP

ICS65.020.30

B44

中国实验动物学会团体标准

T/CALAS96—2020

实验动物 螺杆菌环介导等温扩增

（LAMP）检测方法

Laboratoryanimal-DetectionofHelicobactersp.byloop-mediatedisothermalampfication

2020-12-01 发布 2021-01-01 实施

中国实验动物学会发布

前 言

本文件按照GB/T1.1—2020给出的规则起草。本文件附录A为资料性附录。

本文件由中国实验动物学会归口。

本文件由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。

本文件由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、扬州大学。

本文件主要起草人：冯洁、张泉、谢建芸、高诚、朱立麒、钱淼。

实验动物螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法

范围

本文件规定了实验动物螺杆菌LAMP检测方法。本文件适用于实验动物螺杆菌的检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本

（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489 《实验室生物安全通用要求》

GB/T19495.2 《转基因产品检测实验室技术要求》

术语、定义和缩略语

下列术语、定义和缩略语适用于本文件。

环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，LAMP

一种新型核酸扩增方法。针对靶基因上的6个区域设计2对特异引物，在链置换DNA

聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，以特异性引物为延伸起点，于60℃～65℃恒温扩增。可在15min～60min内实现109～1010倍的核酸扩增，扩增产物由一系列复杂的大小不等的DNA混合而成。

缩略语

DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

LAMP 环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）

16SrRNA 16S核糖体核糖核酸（16SribosomalRNA）

基本原理

采用合适的方法提取检测样本中的细菌DNA。根据螺杆菌属16SrRNA基因序列保守区域设计一组特异性LAMP引物，对DNA模板进行扩增，根据LAMP扩增结果判定样品中是否含有螺杆菌。

PAGE141实验动物螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）

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实验动物螺杆菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法

PAGE142第三篇实验动物检测方法系列标准

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第三篇实验动物检测方法系列标准

设计的LAMP扩增引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物LF，可特异性识别靶序列上的6个区域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）启动循环链置换反应，在16SrRNA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有许多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物（dNTP）中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量白色焦磷酸镁沉淀。焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合，产生黄绿色荧光。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，仅用肉眼观察反应液颜色变化，即可判定扩增与否，无需繁琐的电泳和紫外观察。

设备和材料

离心机：2000r/min～13000r/min。

水浴锅或恒温孵育器：60℃～65℃。

超净工作台。

生物安全柜。

电泳仪。

振荡器。

组织匀浆器。

冰箱：2℃～5℃、–20℃。

微量移液器（0.1?L～2?L、1?L～10?L、10?L～100?L、100?L～1000?L）及无菌吸头。

无菌透明离心管：1.5mL、5mL、15mL。

LAMP反应管（透明）。

试剂*

除特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准，各溶液按照附录A所示方法进行配制。

灭菌PBS。

无水乙醇。

钙黄绿素荧光染料。

灭菌去离子水。

DNA抽提试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号DP302]或其他等效试剂。

LAMP试剂：LMPDNA扩增试剂盒（北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP204）或其他等效试剂。

本章给出试剂盒相关信息是为了方便本文件使用