TNAIA003—2020肌肉中肌苷肌苷酸的测定高效液相色谱法.docxVIP

ICS67.120X22

团 体 标 准

T/NAIA003—2020

肌肉中肌苷肌苷酸的测定高效液相色谱法

DeterminationofinosineandinosinicacidinmuscleHighperformanceliquidchromatography

2020-07-07发布 2020-08-01实施

宁夏化学分析测试协会 发布

PAGE

PAGE1

前言

本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分标准的结构和编写》规定编写。

本标准由宁夏化学分析测试协会提出并归口。

本标准由宁夏大学、宁夏饲料工程技术研究中心、宁夏兽药饲料监察所、宁夏饲料工作站、宁夏农林科学院、宁夏昊标检测服务研究院、宁夏化学分析测试协会起草。

本标准主要起草人：辛国省、卜姣姣、刘辉、燕翀、杨仪、丁园、高巧仙、王建林、武晓宏、谢荣国、张小飞、张艳、王京。

本标准为首次发布。

肌肉中肌苷肌苷酸的测定

高效液相色谱法

范围

本标准规定了肌肉中肌苷肌苷酸高效液相色谱法的测定。本标准适用于肌肉中肌苷肌苷酸的测定。

本方法检测限为：0.05g/kg。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单位）适用于本标准。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T9695.19肉与肉制品、取样方法

原理

肌肉组织中肌苷肌苷酸经高氯酸溶液提取后，与碱反应生成化学状态稳定的肌苷酸钠，在254nm波长下紫外检测器检测，外标法定量。

试剂与材料

除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水

高氯酸。

5%高氯酸溶液：取5mL高氯酸加入95mL水中。

磷酸。

三乙胺。

甲醇（色谱纯）。

肌苷标准品（纯度不低于99.0%）。

肌苷标准储备液（0.8mg/mL）：称取肌苷标准品（4.6）20mg（准确至0.1mg）于25mL

容量瓶中，用水定容。置于4℃冰箱保存，有效期3个月。

肌苷酸标准品（纯度不低于99.0%）。

肌苷酸标准储备液（1mg/mL）：称取肌苷酸标准品（4.8）50mg（准确至0.1mg）于50mL

容量瓶中，用水定容。置于4℃冰箱保存，有效期3个月。

氢氧化钠。

氢氧化钠溶液：2mol/L。

磷酸三乙胺混合溶液：分别取3.5mL磷酸（4.3）和7.2mL三乙胺（4.4），加入200mL

水中混匀，用三乙胺（4.4）调pH至6.5，用水定容至1L。

仪器和设备

实验室用粉碎机或研钵。

分析天平：感量0.0001g。

均质机。

高效液相色谱仪：配紫外检测器。

高速离心机。

超声波。

容量瓶：50mL、25mL。

移液管：玻璃移液管0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL。

砂芯过滤装置。

试样制备与保存

取肌肉组织，加液氮研磨或粉碎后置于-80℃冰箱备用。

注：在采样和制备过程中，应避免试样污染，如长途运输应加液氮或冰袋保存。

测定步骤

试样提取

平行做两份试验。称取2g（准确至0.0001g），置于50mL离心管中，用20mL预冷的5%高氯酸溶液（4.2）分3次匀浆，匀浆液在4℃下以4000r/min离心10min，上清液转入50mL烧杯中，合并上清液，用氢氧化钠溶液（4.11）调pH至6.5，用蒸馏水定容至50mL，摇匀，经0.45μm滤膜过滤装入进样小瓶待测。随同试样进行空白试验。除不称取样品外，均按试样步骤进行。

色谱条件

色谱柱：C18，长250mm，内径4.6mm，粒径5μm，或性能相当；柱温：25℃；

进样量：20μl；

流动相：磷酸三乙胺溶液（4.12）+甲醇（4.5）=95+5混匀，经0.45μm滤膜过滤，超声波脱气；

流速：1mL/min；检测波长：254nm。

标准系列溶液

准确吸取标准储备液（4.7、4.9）0mL、0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL、2mL肌苷肌苷酸储备液分别置于25mL容量瓶中，用水定容。浓度分别为：肌苷：0μg/mL、3.2μg/mL、6.4μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL。肌苷酸：0μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。现配现用。

测定

按照7.2给出参考色谱条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。

标准曲线绘制

试样溶液与标准溶液中肌苷、肌苷酸保留时间相对偏差在±2.5%之内。在线性范围内，以肌苷、肌苷酸浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标；绘制标准曲线，标准曲线