萤光素酶报告基因技术.pptxVIP

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－萤光素酶报告基因技术

自然界的萤光 发光海星 发光甲壳虫发光真菌发光节虫

自然界的萤光发光鱼 发光甲虫

自然界的萤光萤火虫

细胞信号转导途径启动子/增强子受体结合病毒/细胞相互作用转录因子药物诱导作用或”效果”报告基因的作用

荧光-Fluorescence萤光-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence

萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）是化学发光（Chemilumi-nescence）的一种，激发能量来自化学反应吸收来自光源的光，再发射另一光子萤光发光计（Luminometer）荧光计（Fluorometer）液闪仪（ScintilationCounter）电荷耦合装置光学成像系统（CCDopiticalimagingsystem）荧光显微镜

各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶优越的灵敏度高信号值无内源活性需要底物?-gal灵敏度好细菌，血清等内源活性高需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）灵敏度好植物中内源活性低90%的E.coli,人／动物细胞中有内源活性酶的扩散可引起“过度报告”需要底物SEAP（分泌性碱性磷酸酶）分泌性报告基因(不需裂解)在HeLa,癌和其它细胞类型中有高的内源活性需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)放射性的灵敏度底50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋白）显微镜:亚细胞定位不需底物背景可能高折叠“情形”可导致信号差别

萤光素酶报告基因的主要优点非放射性检测快（比CAT等）灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）线形范围广（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力

原理:制备含有luc/Rluc的DNA转染提供刺激测量萤光调节序列Luc２萤光素酶报告基因的使用

在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义RNA受体蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制

启动子/增强子分析“碰撞启动子”:全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+

FireflyandRenilla

萤火虫生物萤光的化学+PPi+CO2+Light萤光素:Mg2+萤光素+ATP+O2萤光素酶萤光素酶:单体,61,000DaltonsOxyluciferin+AMP辅-底物: ATP.Mg2+

Coelenterazine1+O22萤光素酶3Coelenteramide4+CO2+Light5萤光素酶: 单体,36,000Daltons6萤光素:(Coelenterazine)7海肾萤光素酶反应

EnzymestructuresFireflyRenilla

为什么要使用双报告基因01报告基因A(首要信号)02报告基因B(第二信号)03特异生物学反馈+非特异生物学反馈04非特异生物学反馈05检测结果06比较首要与第二信号确定特异生物学反馈07

细胞可能有内源脱乙酰基酶?-Gal或GUS活性.

CAT,?-Gal和GUS检测是终点检测.

不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或?-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．1传统的双报告基因的缺点2

双萤光素酶报告基因系统比用CAT和?-Gal做内对照的优点灵敏两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低速度样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成方便一管完成检测，样品不必分份

用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）实验质粒01对照质粒02用海肾萤光素酶作对照归一实验变化03归一反应=04对照的（海肾萤光素酶)05实验的(萤火虫萤光素酶)06萤火虫萤光素酶07海肾萤光素酶08

数据处理举例第一天 萤光素酶活性(RLU) 比率 归一的活性样品处理重复 Ｆ Ｒ