MTX联合CTX对CIA小鼠关节滑膜FKN及CX3CR1表达的影响及其意义.docxVIP

MTX联合CTX对CIA小鼠关节滑膜FKN及CX3CR1表达的影响及其意义

摘要

本研究旨在探讨甲氨蝶呤（MTX）联合环磷酰胺（CTX）对胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠关节滑膜中趋化因子fractalkine（FKN）及其受体CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）表达的影响及其潜在意义。通过建立CIA小鼠模型，将实验小鼠随机分为对照组、模型组、MTX单药治疗组、CTX单药治疗组以及MTX联合CTX治疗组，采用免疫组化、实时荧光定量PCR等技术检测关节滑膜中FKN及CX3CR1的表达水平，并观察小鼠关节炎症程度。结果表明，MTX联合CTX治疗能够显著降低CIA小鼠关节滑膜中FKN及CX3CR1的表达，有效减轻关节炎症反应，其作用机制可能与抑制FKN/CX3CR1信号通路介导的炎症细胞浸润和滑膜细胞增殖有关。本研究为类风湿关节炎的治疗提供了新的理论依据和潜在治疗策略。

关键词

甲氨蝶呤；环磷酰胺；胶原诱导性关节炎；趋化因子fractalkine；CX3C趋化因子受体1

一、引言

类风湿关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种常见的慢性、系统性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症、软骨和骨破坏为主要特征，严重影响患者的生活质量[1]。尽管目前已有多种治疗方法，但仍有部分患者治疗效果不佳，因此寻找更有效的治疗策略具有重要意义。

趋化因子fractalkine（FKN）及其受体CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）组成的FKN/CX3CR1信号通路在RA的发病机制中发挥重要作用[2]。FKN是一种独特的膜结合型趋化因子，可通过酶切后以可溶性形式发挥作用，其与CX3CR1特异性结合后，能够招募炎症细胞如单核细胞、T淋巴细胞等向关节滑膜部位浸润，并促进滑膜细胞的增殖和炎症因子的释放，进而加剧关节炎症反应和组织破坏[3]。

甲氨蝶呤（MTX）是治疗RA的一线药物，通过抑制二氢叶酸还原酶，干扰嘌呤和嘧啶的合成，从而抑制免疫细胞的增殖和炎症反应[4]。环磷酰胺（CTX）是一种烷化剂，具有强大的免疫抑制作用，可通过破坏DNA结构和功能，抑制淋巴细胞的增殖和活化[5]。已有研究表明，MTX和CTX在治疗RA方面均有一定疗效，但关于两者联合应用对RA发病机制中关键分子FKN及CX3CR1表达的影响尚未明确。因此，本研究通过建立胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型，探讨MTX联合CTX对CIA小鼠关节滑膜FKN及CX3CR1表达的影响及其潜在意义，为RA的治疗提供新的思路。

二、材料与方法

（一）实验动物

选取6-8周龄、体重18-22g的雌性C57BL/6小鼠60只，购自[具体实验动物中心名称]，动物饲养于[具体饲养环境条件，如温度22±2℃、湿度50%-60%、12h光照/12h黑暗循环]的SPF级动物房，自由饮食饮水。

（二）主要试剂与仪器

试剂：Ⅱ型胶原（购自[具体公司名称]）、完全弗氏佐剂（CFA，购自[具体公司名称]）、甲氨蝶呤（MTX，购自[具体公司名称]）、环磷酰胺（CTX，购自[具体公司名称]）、兔抗小鼠FKN多克隆抗体（购自[具体公司名称]）、兔抗小鼠CX3CR1多克隆抗体（购自[具体公司名称]）、HRP标记的羊抗兔IgG（购自[具体公司名称]）、TRIzol试剂（购自[具体公司名称]）、逆转录试剂盒（购自[具体公司名称]）、SYBRGreenPCRMasterMix（购自[具体公司名称]）。

仪器：酶标仪（[具体品牌及型号]）、实时荧光定量PCR仪（[具体品牌及型号]）、冷冻切片机（[具体品牌及型号]）、光学显微镜（[具体品牌及型号]）。

（三）CIA小鼠模型的建立

将Ⅱ型胶原溶于0.05mol/L醋酸溶液中，4℃过夜，使其浓度为2mg/ml。将等体积的完全弗氏佐剂与Ⅱ型胶原溶液充分混合，制备成乳剂。在小鼠背部皮下多点注射乳剂（每只小鼠注射0.1ml）进行初次免疫。21天后，用同样的乳剂进行加强免疫。对照组小鼠注射等体积的生理盐水与完全弗氏佐剂混合液。

（四）分组与处理

将建模成功的CIA小鼠随机分为模型组、MTX单药治疗组（MTX，10mg/kg，每周腹腔注射1次）、CTX单药治疗组（CTX，20mg/kg，每周腹腔注射1次）、MTX联合CTX治疗组（MTX10mg/kg+CTX20mg/kg，每周腹腔注射1次），另设正常对照组（注射等体积生理盐水），每组10只。连续治疗4周后，处死小鼠，取关