布鲁氏菌效应蛋白BspH部分生物信息学分析及与其互作宿主蛋白的筛选.pdfVIP

第46卷第9期中国预防兽医学报Vol.46No.9

2024年9月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineSep.2024

doi：10.3969/j.issn.1008-0589.202401006

布鲁氏菌效应蛋白BspH部分生物信息学分析及与其

互作宿主蛋白的筛选

12,3*1111345*

印双红，张俊波，孔凯旋，杜昌青，孙馨，李寅翠，张孟琴，王书利，易继海

（1.铜仁学院大健康学院，贵州铜仁554300；2.铜仁学院农林工程与规划学院，贵州铜仁554300；

3.铜仁学院贵州省梵净山地区生物多样性保护与利用重点实验室，贵州铜仁554300；

4.商丘师范学院生物与食品学院，河南商丘476000；5.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）

摘要：为分析BspH蛋白的部分分子生物信息学及与其互作的宿主蛋白，本研究通过在线软件Predicting

AntigenicPeptides分析BspH蛋白的抗原决定簇、SWISSMODEL预测BspH蛋白的三级结构。委托公司合成BspH基因

并构建重组表达质粒pET-B2m-BspH，经酶切和测序鉴定正确后，将pET-B2m-BspH转化BL21（DE3）感受态细胞后

经IPTG诱导表达重组BspH蛋白（rBspH），利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白，并经SDS检测。将纯化的

rBspH免疫日本大耳兔4次，4免后1周即首免后49d采血分离血清制备BspH蛋白多克隆抗体（PAb）并经ELISA检测

其效价，采用westernblot检测该PAb与BspH蛋白的反应性。预测结果显示，BspH蛋白有19个抗原决定簇，三级结

构以α-螺旋为主。SDS结果显示，在65ku处出现目的条带，且rBspH主要以包涵体的形式表达，纯化效果较

好。ELISA和westernblot结果显示，制备的PAb效价且该PAb可以与纯化的rBspH反应，在65ku处

出现特异性条带。将委托公司构建的重组诱饵质粒pGBKT7-BspH和pGADT7共转化酵母菌感受态细胞，30℃培养

3d~5d后上述转化的酵母菌在DDO/X培养板上长出蓝色菌落，表明pGBKT7-BspH质粒已转入酵母菌中，且表达了

诱饵蛋白BspH；在TDO/X和QDO/X/A培养板上均不生长，且在DDO/X培养板上形成的菌落大小和数量与阴性对照

酵母菌基本一致，表明诱饵蛋白BspH在酵母菌中无自激活活性和毒性。在此基础上，将pGBKT7-BspH和小鼠

RAW264.7细胞cDNA文库共转化酵母菌Y2HGold感受态细胞，以表达的BspH作为诱饵蛋白，采用酵母双杂交技术

从上述cDNA文库中初步鉴定与BspH存在相互作用的宿主蛋白，结果显示共有28个阳性菌落变蓝，分别提取该28

个阳性菌落中的质粒并测序，将测序后的序列在NCBI数据库进行BLASTX比对分析，共得到18种同源性为88.93%~

100%并能与BspH蛋白相互作用的宿主蛋白，对其中的5个宿主蛋白进一步经回交验证试验，结果显示，BspH与5

个宿主蛋白AKIP1、UBXN1、HSP90AA1、PRC1、PGM1均存在互作。本研究表达并纯化了布鲁氏菌效应蛋白

BspH，制备了BspH蛋白的PAb，并筛选到与BspH蛋白互作的5个宿主蛋白，为进一步探究BspH蛋白在布鲁氏菌感

染中的功能及其致病机制提供参考依据。

关键词：布鲁氏菌；效应蛋白BspH；生物信息学分析；酵母双杂交；互作蛋白

中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589（2024）09-0938-08

PartialbioinformaticsanalysisofBrucellaeffectorproteinBspHand

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