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小干扰RNA下调热休克蛋白70对A549细胞增殖与凋亡的影响

摘要

本研究旨在探究小干扰RNA（siRNA）下调热休克蛋白70（HSP70）对人肺腺癌细胞A549增殖与凋亡的影响及其潜在机制。通过设计针对HSP70的siRNA并转染A549细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率，Westernblot检测相关蛋白表达水平。结果表明，HSP70siRNA可显著抑制A549细胞的增殖，促进细胞凋亡，其机制可能与调控PI3K/AKT和Bcl-2/Bax信号通路相关。本研究为肺癌的靶向治疗提供了新的理论依据。

关键词

小干扰RNA；热休克蛋白70；A549细胞；细胞增殖；细胞凋亡

一、引言

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。人肺腺癌细胞A549是研究肺癌发生发展机制及药物治疗的常用细胞模型。热休克蛋白70（HSP70）是热休克蛋白家族中的重要成员，在细胞受到各种应激刺激时大量表达，参与细胞的生长、发育、分化以及凋亡等多种生物学过程[1]。近年来研究发现，HSP70在多种肿瘤细胞中异常高表达，与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及耐药密切相关[2]。小干扰RNA（siRNA）技术是一种高效、特异的基因沉默技术，能够通过RNA干扰（RNAi）机制下调靶基因的表达。本研究利用siRNA技术下调A549细胞中HSP70的表达，观察其对细胞增殖与凋亡的影响，为肺癌的靶向治疗提供新的思路和潜在靶点。

二、材料与方法

（一）细胞与试剂

人肺腺癌细胞A549购自中国典型培养物保藏中心。RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶购自Gibco公司；HSP70siRNA及阴性对照siRNA（NCsiRNA）由上海吉玛制药技术有限公司合成；Lipofectamine2000转染试剂购自Invitrogen公司；CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD公司；兔抗人HSP70、Bcl-2、Bax、p-AKT、AKT、p-PI3K、PI3K抗体及HRP标记的山羊抗兔IgG抗体均购自CellSignalingTechnology公司。

（二）细胞培养与转染

将A549细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO?的培养箱中培养。待细胞汇合度达到70%-80%时，按照Lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染操作。将细胞分为三组：空白对照组（不做任何处理）、阴性对照组（转染NCsiRNA）、实验组（转染HSP70siRNA）。转染6h后更换新鲜培养基，继续培养。

（三）CCK-8法检测细胞增殖

转染后24h、48h、72h，将各组细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，每孔加入100μL培养基，每组设置5个复孔。培养相应时间后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2h，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值），根据OD值绘制细胞生长曲线，评估细胞增殖能力。

（四）流式细胞术检测细胞凋亡

转染72h后，收集各组细胞，PBS洗涤2次，按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作。将细胞重悬于结合缓冲液中，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室温避光孵育15min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并用FlowJo软件分析数据。

（五）Westernblot检测蛋白表达

转染72h后，收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品进行SDS电泳，转膜后用5%脱脂牛奶封闭2h，加入相应的一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加入HRP标记的二抗室温孵育2h，再次洗涤后用ECL化学发光试剂显色，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

（六）统计学分析

实验数据采用SPSS22.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD-t检验，P0.05表示差异具有统计学意义。

三、结果

（一）HSP70siRNA对A549细胞中HSP70表达的影响

Westernblot结果显示，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组A549细胞中HSP70蛋白表达水平显著降低（P0.05），而空白对照组和阴性对照组之