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外泌体分离技术实验操作指南

外泌体作为细胞间信息传递的重要媒介，其研究价值日益凸显。而获得高纯度、高活性的外泌体，是后续深入研究其生物学功能、疾病标志物筛选及潜在治疗应用的基础。本指南旨在为科研人员提供一份相对全面且实用的外泌体分离技术实验操作参考，涵盖实验前准备、主要分离方法的操作流程、注意事项及质量控制等关键环节，以期助力相关研究工作的顺利开展。

一、实验前准备

实验前的充分准备是确保外泌体分离成功的首要环节，任何细节的疏漏都可能影响最终结果的质量。

1.1试剂与耗材准备

*样本来源：明确样本类型（如细胞培养上清、血清、血浆、尿液、唾液、脑脊液等），不同样本的预处理和分离策略存在差异。

*主要试剂：根据选定的分离方法准备相应试剂。例如，超速离心法可能仅需PBS或生理盐水；PEG沉淀法需准备PEG溶液（如PEG6000或PEG8000）；商业试剂盒则需按照说明书准备配套试剂及必要的缓冲液。所有试剂均应选择高纯度级别，尤其是用于后续分子生物学分析的实验，应注意使用无RNA酶、无DNA酶的试剂。

*缓冲液配制：如PBS，建议使用无钙镁离子的PBS（PBS(-)），并经0.22μm滤膜过滤除菌，分装保存于4℃或-20℃。配制过程中应使用无RNA酶的水和容器。

*耗材：

*离心管：根据离心需求选择合适材质（如超速离心需使用特定的超速离心管）、规格的离心管，确保无菌、无酶、低吸附。

*移液枪头：选择无菌、无酶、低吸附的滤芯枪头，避免交叉污染和样本损失。

*滤膜：用于样本预处理或外泌体浓缩/洗涤的滤膜（如0.22μm、0.45μm滤膜）。

*其他：无菌容器、记号笔、parafilm封口膜等。

1.2仪器设备准备与检查

*离心机：根据分离方法准备相应的离心机，如台式高速离心机、台式超速离心机或落地式超速离心机。使用前需检查离心机状态，确保转子匹配、离心腔清洁、平衡装置正常。

*移液枪：校准移液枪，确保移液准确性。

*超净工作台：操作过程应在超净工作台内进行，以保证无菌环境，减少污染。

*涡旋混匀器、超声仪（如需）：用于外泌体沉淀的重悬。

*天平：用于离心管平衡。

*冰箱、低温冰箱、液氮罐（如需长期保存）：确保温度稳定。

1.3实验方案设计与确认

*样本量估算：根据后续实验需求和所选分离方法的回收率，合理估算初始样本量。

*预实验：对于新样本或新方法，建议先进行预实验摸索条件，如PEG浓度、离心时间、转速等。

*对照设置：必要时设置阴性对照（如无细胞培养上清）和阳性对照。

二、主要分离技术操作流程

外泌体分离方法多样，各有其优缺点和适用场景。以下介绍几种常用方法的基本操作流程。

2.1超速离心法（Ultracentrifugation,UC）

超速离心法是外泌体分离的经典方法，基于外泌体的沉降系数进行分离，通常结合差速离心步骤。

2.1.1样本预处理（以细胞培养上清为例）

1.收集上清：细胞培养至合适密度后，收集细胞培养上清。对于贴壁细胞，应在收集前更换新鲜的无外泌体血清（或无血清）培养基培养一段时间（通常12-48小时），以减少血清中外泌体的干扰。

2.低速离心去除细胞：将收集的上清转移至离心管中，4℃，较低转速（如300×g-500×g）离心10-15分钟，去除完整细胞及大的细胞团块。

3.高速离心去除细胞碎片：小心吸取上一步离心后的上清，转移至新的离心管，4℃，较高转速（如2000×g-3000×g）离心15-30分钟，去除较大的细胞碎片和凋亡小体。

4.（可选）过滤：为进一步去除杂质，防止后续离心管堵塞，可将上清通过0.22μm或0.45μm滤膜过滤。此步骤可能损失部分较大粒径的外泌体，需权衡。

2.1.2差速超速离心分离外泌体

1.第一次超速离心（去除微囊泡等较大颗粒）：将预处理后的上清转移至超速离心管中，使用水平转子或角转子，4℃，较高转速（如10000×g-20000×g）离心30-60分钟。

2.收集上清：离心结束后，小心吸取上清，避免触碰管底和管壁的沉淀（此沉淀富含微囊泡等）。

3.第二次超速离心（沉淀外泌体）：将上述上清转移至新的超速离心管（确保平衡），4℃，超速离心（通常100000×g-120000×g）离心60-120分钟。

4.弃上清，洗涤沉淀：离心结束后，弃去上清，可见管底有微量（通常为乳白色或淡黄色）沉淀。用适量预冷的PBS（或其他缓冲液）轻柔重悬沉淀，注意避免产生气泡。

5.第三次超速离心（纯化外泌体）：将重悬液转移至新的超速离心管（平衡），4℃，100000×g-120000×g再次离心60-90分钟。

6.收集外泌体：弃去上清，