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含cry8E基因绿僵菌工程菌的构建及致病机制探究

一、引言

1.1研究背景

随着农业现代化的推进，害虫防治一直是保障农作物产量和质量的关键环节。长期以来，化学农药在害虫防治中占据主导地位，然而，其带来的环境污染、害虫抗药性增强以及对非靶标生物的伤害等问题日益凸显。在此背景下，生物防治作为一种绿色、可持续的害虫防治策略，受到了广泛关注。绿僵菌（Metarhiziumspp.）作为昆虫病原真菌的重要成员，在生物防治领域展现出巨大的潜力。

绿僵菌广泛分布于土壤中，能侵染多个目、42个科的200多种昆虫，还能寄生螨类及线虫等。其孢子可通过风、水等因素传播，进入害虫体内后，在适宜条件下萌发并生长，分泌多种酶类和毒素，破坏害虫的组织和生理功能，最终导致害虫死亡。例如，在澳大利亚和巴西，金龟子绿僵菌被广泛用于防治甘蔗和牧草害虫，并取得了较好的效果；在非洲，黄绿绿僵菌防治蝗虫的实验也取得了初步成功。此外，绿僵菌的天然毒素还可以通过溶液、微粒等多种方式应用于农业生物防治。然而，天然绿僵菌的防治效果往往受到环境因素的制约，其天然毒素的应用效果也不稳定，且具有一定的剂量限制，这些因素限制了绿僵菌在生物防治中的大规模应用。

CRY（crystal）蛋白质是一类常见的杀虫蛋白，在杀虫防治领域应用广泛。Cry8E基因是cry蛋白家族最新发现的成员，具有广谱杀虫活性，对玉米象、银粉虱等多种害虫具有显著的防治效果。将cry8E基因导入绿僵菌中，构建含有cry8E基因的绿僵菌工程菌，有望结合两者的优势，提高绿僵菌的防治能力，增强其对害虫的防治效果。这种基因工程手段不仅可以拓展绿僵菌的杀虫谱，还可能提高其杀虫效率和稳定性，为农业害虫的生物防治提供更有效的工具。同时，对含有cry8E基因绿僵菌工程菌致病机制的研究，有助于深入了解其作用方式，为进一步优化工程菌和开发新型生物防治策略提供理论基础。

1.2研究目的与意义

本研究旨在通过基因工程技术，将具有广谱杀虫活性的cry8E基因导入绿僵菌，构建含有cry8E基因的绿僵菌工程菌，并对其致病机制进行初步分析，具体目标如下：一是成功构建含有cry8E基因的绿僵菌工程菌，实现cry8E基因在绿僵菌中的稳定表达；二是测定工程菌对玉米象、银粉虱等害虫的防治效果，与天然绿僵菌进行对比，评估工程菌在实际应用中的优势；三是通过分析工程菌的基因表达谱和代谢物谱，初步揭示其致病机制，为进一步优化工程菌提供理论依据。

本研究具有重要的理论与实践意义。在理论层面，对含有cry8E基因绿僵菌工程菌致病机制的研究，有助于深入理解昆虫病原真菌与杀虫蛋白之间的协同作用机制，丰富昆虫病原真菌致病理论。通过分析工程菌的基因表达谱和代谢物谱，可以揭示基因工程改造对绿僵菌生理代谢的影响，为昆虫病原真菌的分子生物学研究提供新的视角。

在实践应用方面，构建的含有cry8E基因绿僵菌工程菌有望为农业害虫生物防治提供更高效、安全的生物防治手段。与传统化学农药相比，工程菌具有环保、不易产生抗药性等优点，符合可持续农业发展的需求。同时，本研究的成果也可为其他昆虫病原真菌工程菌的构建和应用提供参考，推动生物防治技术的发展。

1.3国内外研究现状

在昆虫病原真菌领域，绿僵菌因其广泛的寄主范围和良好的生物防治潜力，一直是研究的热点。国内外学者对绿僵菌的分类、生物学特性、致病机制及应用等方面进行了大量研究。

在分类方面，自Sorokin于1883年建立绿僵菌属以来，由于不同学者采用的分类标准不统一，绿僵菌属的分类状况曾一度较为混乱。目前，国际上广泛接受的分类观点是将绿僵菌划分为金龟子绿僵菌、黄绿绿僵菌和白色绿僵菌3个种，其中黄绿绿僵菌下分5个变种，金龟子绿僵菌下分4个变种。随着分子生物学技术的发展，基于DNA序列分析、分子标记等方法的应用，进一步细化和准确了绿僵菌的分类体系，为绿僵菌资源的开发和利用提供了基础。

在生物学特性研究中，环境条件对绿僵菌生长的影响备受关注。研究表明，绿僵菌生长的最适温度一般为25℃左右，温度高于40℃或低于7-8℃时，其生长会受到显著抑制；最适空气相对湿度为98%-100%。孢子的存活受物理和化学因素影响较大，如在4℃、空气相对湿度为0时，孢子存活时间较短；而在适宜的温度和湿度条件下，孢子存活时间会延长。此外，不同菌株的毒力存在差异，樊美珍等分析了17株绿僵菌的酯酶同功酶，发现其与毒力之间存在一定的相关性。

在致病机制方面，绿僵菌侵染昆虫的过程复杂，涉及多个环节。绿僵菌孢子附着在昆虫体表后，在适宜条件下萌发产生芽管，芽管通过分泌蛋白酶、几丁质酶和酯酶等多种酶类，降解昆虫表皮的蛋白质和几丁质等成分，从而穿透昆虫表皮进入体内。进入