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生物实验SOD活性测定标准操作流程

一、实验目的

本流程旨在规范超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）活性的测定操作，确保实验结果的准确性、可靠性与可重复性。通过本标准流程，研究者能够定量评估生物样品（如组织匀浆、细胞裂解液、血清、植物提取物等）中SOD的活性水平，为相关生理、病理机制研究及药物筛选等提供基础数据。

二、实验原理

本实验采用氮蓝四唑（NBT）光还原法测定SOD活性。其基本原理是：在光照条件下，黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基（O??·）。O??·可使无色的氮蓝四唑（NBT）还原为蓝色的甲臜（Formazan），该产物在特定波长（通常为560nm）处有最大光吸收。SOD作为O??·的专一清除剂，能够通过歧化反应将O??·转化为H?O?和O?，从而抑制NBT的光还原反应。在一定范围内，甲臜的生成量与O??·的浓度呈正相关，而SOD活性与NBT光还原的抑制程度呈正相关。通过测定样品对NBT光还原反应的抑制率，即可计算出SOD的活性单位。通常将抑制NBT光还原反应50%所需的酶量定义为一个SOD活性单位（U）。

三、主要试剂与溶液配制

（一）主要试剂

1.磷酸二氢钾（KH?PO?）

2.磷酸氢二钾（K?HPO?·3H?O）

3.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?）

4.黄嘌呤（Xanthine）

5.黄嘌呤氧化酶（XanthineOxidase,XOD）

6.氮蓝四唑（NitroblueTetrazolium,NBT）

7.牛血清白蛋白（BSA，可选，用于标准曲线制作）

8.SOD标准品（可选，用于方法学验证或标准曲线制作）

9.氢氧化钠（NaOH）

10.盐酸（HCl）

11.去离子水或超纯水

（二）主要溶液配制

1.0.05mol/L磷酸缓冲液（PBS,pH7.8）：

*A液（0.05mol/LKH?PO?）：称取一定量KH?PO?，用少量去离子水溶解后定容。

*B液（0.05mol/LK?HPO?·3H?O）：称取一定量K?HPO?·3H?O，用少量去离子水溶解后定容。

*取A液XmL与B液YmL混合，用pH计调节至pH7.8，然后用去离子水稀释至所需体积。

2.0.1mmol/LEDTA-Na?溶液：称取适量EDTA-Na?，用0.05mol/LPBS（pH7.8）溶解并定容。

3.50mmol/L黄嘌呤溶液：称取适量黄嘌呤，先用少量0.1mol/LNaOH溶液溶解，再用0.05mol/LPBS（pH7.8）定容至所需体积，避光冷藏保存，使用前复温。

4.75μmol/LNBT溶液：称取适量NBT，用0.05mol/LPBS（pH7.8）溶解并定容，避光冷藏保存，现配现用或分装冻存避免反复冻融。

5.黄嘌呤氧化酶溶液（XOD）：根据酶活力单位及实验需求，用0.05mol/LPBS（pH7.8）稀释至适当浓度（通常使其在反应体系中能产生足够量的O??·，具体浓度需预实验确定），现配现用。

6.酶提取缓冲液（根据样品类型选择，例如：0.05mol/LPBS,pH7.8，含0.1mmol/LEDTA-Na?）：将上述PBS与EDTA-Na?溶液按比例混合。

四、主要仪器设备

1.紫外可见分光光度计

2.恒温水浴锅

3.高速冷冻离心机

4.精密pH计

5.分析天平（感量0.1mg）

6.移液器（1mL,200μL,20μL,10μL等）及配套吸头

7.离心管、试管、容量瓶、烧杯等玻璃或塑料器皿

8.涡旋混匀器

9.光照反应装置（如特定波长的光源或日光灯下特定位置，需保证光照强度和温度稳定）

10.冰箱（4℃，-20℃）

五、操作步骤

（一）样品制备（以动物组织为例）

1.取新鲜组织，用预冷的生理盐水或PBS洗净血污，滤纸吸干水分。

2.称重后剪碎，按质量体积比（如1:9或1:19）加入预冷的酶提取缓冲液。

3.在冰浴条件下，用组织匀浆器或超声波破碎仪将组织匀浆化。

4.将匀浆液转移至离心管中，4℃下高速离心（具体转速和时间根据组织类型优化，如10000×g离心15-30分钟）。

5.小心吸取上清液，即为粗酶提取液。测定前可根据预期酶活性适当稀释。提取的酶液应置于冰上或4℃保存，尽快测定。

（二）SOD活性测定（NBT光还原法）

1.反应体系配制：在石英比色皿或透明试管中依次加入以下试剂（具体体积根据实验优化，以下为典型示例）：

*0.05mol/LPBS(pH7.8)：XmL

*0.1mmol/LEDTA-Na?：YmL

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