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激光共焦高速扫描显微成像的高帧速重构算法

激光共焦扫描显微镜相比于传统显微镜具有更高的分辨率，在医

学、生物学等领域有着广泛的应用，同时激光共焦扫描显微镜的高速

成像功能对于活体细胞的研究具有重要意义。尽管国外仪器已经实现

了高速成像，但是由于商业机密等原因，公开的相关文献仅限于光学

设计、扫描硬件控制和单帧图像畸变校正等。为促进国产高速激光共

焦扫描显微成像技术的发展，急需一种自主研发的高速成像技术。

配备二维振镜扫描系统的激光共焦扫描显微镜可以实现高速成

像。两个正交布置的振镜分别在x方向和Y方向偏转聚焦光斑，使光

斑在样品表面移动，其屮x振镜实现快速行扫描，Y振镜实现慢速帧

扫描。振镜扫描速度直接决定了激光共焦扫描显微镜的成像帧速。振

镜的扫描方式有步进式偏转和连续式偏转两种。相比于步进式偏转，

连续式偏转方式消除了行与行、帧与帧之间转换的停留时间，不仅可

以降低步进式偏转反复起、停导致的位置误差，还可以大幅度提高扫

描速度。但是，由于振镜机械运动特.陛与理论参数存在差异，连续式

偏转难以实现行扫描与帧扫描的同步匹配。因此如何将连续的一维扫

描信号序列高精度地重构为多帧二维图像成为了高速成像的关键难点

之一。

为了实现连续多帧成像，本文提出了一种基于连续帧特征区域差

分的高帧速重构算法。该算法在定性分析系统扫描方式与充分考虑振

镜实际与理论运动方式差异的基础上，利用相邻两帧相似性大的特点，

实现了高达300帧/s的高速扫描成像的高精度图像重构，并通过荧光

小球实验对该方法的准确性进行了验证。

1激光共焦高速扫描显微成像系统分析

入射激光经扫描模块后由物镜聚焦在样品上，样品受激发产生的

荧光通过探测光路到达光电倍增管并转换为电信号，数据采集卡按固

定频率（Fc）采集电信号后通过上位机对信号序列的适当处理获得扫

描区域图像。

传统扫描模块通常采用双检流计振镜方案实现X、Y两个方向的

扫描，但是检流计振镜的扫描速度一般不超过2kHz,这极大地限制了

扫描显微镜的成像速度。与检流计振镜不同，共振振镜以一个固有的

谐振频率做简谐运动，其扫描速度可以达到12kHZo为了实现高速扫

描成像，本文在x方向上采用共振振镜进行高速行扫描，在Y方向上

采用检流计振镜进行慢速帧扫描。

共振振镜利用两个可产生机械谐振的谐振棒带动反射镜以一个

固定的频率（Fx）往复转动，并通过恒定不变的输入电压控制其最大

（

偏转角Ax）。检流计振镜利用线圈产生电磁感应驱动反射镜发生偏

转，偏转角度与输入电压成正比，通过周期为2T、幅度为Ay的三角

波电压信号控制其偏转角度同步变化。检流计振镜每转动半个周期

（

T）,聚焦光斑完成一帧图像扫描，单帧图像的全部采样点形成扫描

点阵，扫描轨迹如图1所示。

两振镜的偏转角度随时间的变化如图2所示，以扫描区域屮心作

为坐标原点，物镜焦距为f,则扫描区域x方向最大长度Dx和Y方向最

大宽度Dy分别为：

将扫描轨迹一行的采样点数称为扫描點阵的行点数，扫描轨迹一

列的采样点数称为扫描点阵的列点数，则由扫描成像原理可以得到行

（（

点数估计值px）和列点数估计值py）分别为：

由于机械运动的限制，检流计振镜的偏转角度不能完全按图2（b）

（

所示的理想三角波来变化，每一帧图像的扫描时间T）都会和理想值

（

有偏差，使得扫描点阵列点数（行数）在某个固定值Py）上下浮动。

因此，必须采用合适的算法对信号序列进行动态排列和分割成阵列数

据。

2算法实现

针对扫描的实际点阵行数不断波动的情况，本文提出了一种连续

帧特征区域差分成像算法，经基本图像重建及畸变校正后得到二维组

合图像（多帧图像组合而成的二维图像），然后利用连续帧特征区域

差分的方法搜索出二维组合图像屮所有特征点，并根据特征点所在