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旋毛虫NBL体外培养体系构建及虫体可溶性抗原特征解析

一、引言

1.1研究背景与意义

旋毛虫病是一种严重的食源性人兽共患寄生虫病，其病原体为旋毛形线虫[Trichinellaspiralis（Owen,1835）Railliet,1895]。人们主要因生食或半生食含有旋毛虫幼虫的猪肉及其他动物肉类而感染。在临床上，急性期患者会出现持续性高热、眼睑和面部水肿、全身性肌肉酸痛、过敏性皮疹以及血中嗜酸性粒细胞增多等变态反应性表现。重症患者可能会因并发症而死亡，国际旋毛虫病委员会（InternationalCommissiononTrichinellosis,ICT）在1995-1997年间就报道了1万多例病人，目前旋毛虫病已被列入再度肆虐的疾病（re-emergingdisease）。在我国，随着人们生活水平的提高，饮食方式日益多样化，因食用涮肉、烤肉等未熟透肉类而感染旋毛虫病的风险也在增加，给公共卫生安全带来了威胁。

目前，旋毛虫不能在体外传代培养，这极大地阻碍了对其侵入宿主分子机制、感染宿主后肠道排虫反应分子机制、抗旋毛虫药物筛选及旋毛虫疫苗研制等方面的研究。而新生幼虫（newbornlarvae，NBL）作为旋毛虫生活史中的一个关键阶段，对其进行体外培养研究具有重要意义。通过建立稳定高效的旋毛虫NBL体外培养体系，我们能够深入研究旋毛虫在体外环境下的生长、发育、代谢等生物学特性，为揭示旋毛虫病的发病机制提供重要的实验依据。

对旋毛虫虫体可溶性抗原的分析也是本研究的重要内容。旋毛虫的抗原成分复杂，不同发育阶段既有共同成分，又有各自的期特异性抗原，包括虫体和虫体表面抗原、排泄和分泌抗原及杆细胞颗粒相关抗原等。对虫体可溶性抗原的分析有助于筛选出具有高特异性和敏感性的诊断抗原，从而提高旋毛虫病的诊断准确性。抗原分析还能为旋毛虫疫苗的研制提供关键的候选抗原，推动疫苗的研发进程，对于旋毛虫病的防控具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在旋毛虫NBL体外培养方面，国内外学者进行了大量探索。早期研究发现，加20%小牛血清的RPMI-1640作为培养基，在37℃、5%CO?的二氧化碳培养箱中培养，旋毛虫脱囊蚴能在体外合适培养基中存活较长时间，但虫体无明显增大，表明其生长和发育还需要其它刺激因子。有研究尝试在培养基中添加大鼠肠内容物、小鼠胆汁等活化物，观察对幼虫蜕皮和生长的影响。结果显示，不同活化物对幼虫蜕皮有不同程度的促进作用，且不同肠上皮细胞（如T84和Caco-2细胞）与培养基结合使用时，也会影响幼虫的发育。然而，目前仍未建立起一种能够使旋毛虫NBL在体外长期稳定传代培养的理想体系，培养过程中存在虫体存活率低、生长发育受限等问题。

关于旋毛虫虫体可溶性抗原分析，已有研究表明旋毛虫的各期抗原均可诱导小鼠产生保护性免疫，但不同期的抗原诱导产生的免疫力程度不同。有学者将旋毛虫感染期幼虫在体外培养，收集培养液，利用单克隆抗体经亲合层析分离出3种不同分子量（37K、48K、50/55K）抗原，其中48K蛋白组分为旋毛虫所特有，具有较强的特异性，可诱导高水平的保护性作用。也有研究用旋毛虫幼虫制备全虫粗抗原、分泌颗粒可溶性粗抗原及其纯化抗原，发现纯化抗原的灵敏度和特异性均优于粗抗原。不过，当前对旋毛虫可溶性抗原的研究还不够深入全面，对于抗原的结构、功能以及抗原与宿主免疫系统相互作用的机制等方面仍有待进一步探索。

1.3研究目标与内容

本研究旨在建立一种高效的旋毛虫NBL体外培养体系，提高虫体的存活率和生长发育水平，为后续研究提供稳定的虫源。同时，深入分析旋毛虫虫体可溶性抗原，明确其成分、结构和功能特性，筛选出具有潜在应用价值的抗原分子。

具体研究内容包括：第一，优化旋毛虫NBL体外培养的培养基成分，探索添加不同生长因子、活化物以及与不同细胞共培养等条件对虫体生长发育的影响，通过观察虫体的形态变化、存活率、蜕皮情况等指标，确定最佳培养条件。第二，采用超声破碎等方法制备旋毛虫虫体可溶性抗原，运用SDS-PAGE电泳、Westernblot等技术对可溶性抗原进行分离和鉴定，分析其蛋白组成和免疫反应性。第三，利用免疫亲和层析等技术进一步纯化具有特异性免疫反应的抗原组分，对纯化后的抗原进行结构和功能分析，为旋毛虫病的诊断和疫苗研发提供理论基础和实验依据。

本研究的技术路线如下：首先收集旋毛虫NBL，将其接种于不同条件的培养基中进行培养，定期观察记录虫体生长情况；然后从培养的虫体中提取可溶性抗原，进行初步的分离和鉴定；对筛选出的有价值的抗原进行纯化和深入分析。通过以上步骤，实现对旋毛虫NBL体外培养及虫体可溶性抗原的系统研究。

二、材料与方法

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