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龙眼果实AuxIAA及GH3基因的克隆及其表达调控

摘要

本研究旨在克隆龙眼果实中的AuxIAA及GH3基因，并探究其表达调控机制。通过RT-PCR技术成功从龙眼果实中克隆出AuxIAA及GH3基因的全长cDNA序列，利用生物信息学方法对其序列特征、蛋白质结构进行分析。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测基因在龙眼果实不同发育时期、不同组织中的表达模式，并研究植物激素处理对其表达的影响。结果表明，AuxIAA及GH3基因在龙眼果实发育过程中呈现出特定的时空表达特征，且受生长素、脱落酸等多种植物激素的调控。本研究为深入了解龙眼果实生长发育的分子机制提供了理论依据，也为龙眼果实品质改良提供了潜在的基因资源和技术支持。

关键词

龙眼果实；AuxIAA基因；GH3基因；基因克隆；表达调控

一、引言

龙眼（DimocarpuslonganLour.）是我国南方重要的亚热带水果之一，以其丰富的营养价值和独特的风味深受消费者喜爱。果实的生长发育过程受到多种基因和植物激素的精细调控，其中生长素（auxin）在植物生长发育的各个阶段都发挥着关键作用，如细胞伸长、分裂、分化以及果实的发育和成熟等[1]。AuxIAA（Auxin/Indole-3-aceticacid）和GH3（GretchenHagen3）基因家族是生长素信号转导途径中的重要组成部分[2]。

AuxIAA蛋白是一类短寿命的核蛋白，在生长素信号转导中作为负调控因子发挥作用。在没有生长素的情况下，AuxIAA蛋白与生长素响应因子（ARF）结合，抑制ARF对下游基因的转录激活作用；当生长素存在时，AuxIAA蛋白被泛素-26S蛋白酶体途径降解，释放出ARF，从而启动生长素响应基因的表达[3]。GH3基因家族编码的蛋白能够催化生长素与氨基酸结合，形成无活性的生长素结合物，参与生长素稳态的调控[4]。

尽管AuxIAA和GH3基因在拟南芥、水稻等模式植物中的研究已取得了较多成果，但在龙眼果实中的研究仍相对较少。深入研究龙眼果实中AuxIAA及GH3基因的克隆及其表达调控机制，对于揭示龙眼果实生长发育的分子机制、提高龙眼果实品质具有重要的理论和实践意义。因此，本研究开展了龙眼果实AuxIAA及GH3基因的克隆及其表达调控研究。

二、材料与方法

2.1实验材料

选取生长健壮、长势一致的成年龙眼树（品种：石硖），在果实不同发育时期（幼果期、膨大期、成熟期）采集果实样品，同时采集叶片、茎尖等组织样品，液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。

2.2总RNA的提取及cDNA的合成

采用TRIzol试剂（Invitrogen公司）按照说明书提取龙眼果实及各组织样品的总RNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用NanoDrop2000超微量分光光度计（ThermoScientific公司）测定RNA的浓度和纯度，确保OD260/OD280在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，按照PrimeScriptRTreagentKit（TaKaRa公司）说明书进行反转录，合成第一链cDNA，-20℃保存备用。

2.3引物设计与合成

根据GenBank中已公布的其他植物AuxIAA及GH3基因的保守序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

基因名称

引物序列（5-3）

DlAuxIAA-F

ATGGCTCTCGTCCTCGTC

DlAuxIAA-R

TCACATCGTCGTCGTCATC

DlGH3-F

ATGCTGCTGCTGCTGCTG

DlGH3-R

TCAGCTGCTGCTGCTGCT

2.4基因克隆

以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，cDNA模板1μL，ddH2O9.5μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，使用凝胶回收试剂盒（Omega公司）回收纯化。将回收产物连接到pMD18-T载体（TaKaRa公司）上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆，提取质粒，进行PCR鉴定和测序分析。

2.5生物信息学分析

利用NCBI