基于回文序列构建的自限域催化DNA线路用于灵敏的microRNA成像.pdfVIP

基于回文序列构建的自限域催化DNA线路用于灵敏的

microRNA成像

摘要

对microRNA（miRNA）进行准确检测和原位成像分析，有助于揭示miRNA

在癌症发展中的作用和机制，从而为癌症的早期诊断、治疗和预后评估提供新的思

路和方法。然而，由于细胞内生物环境复杂性，以及miRNA表达谱较低且存在大

量的同源类似物等特点，一直影响着分析结果的准确性和可信度。恒温无酶核酸扩

增技术因其反应时间短、特异性强、不需要特殊的设备和信号扩增效率高等优点，

被广泛应用于构建各种功能性DNA催化杂交线路，以实现细胞内miRNA的成像

分析。但已报道的无酶催化核酸线路往往存在设计复杂，靶标和信号等效反应比，

导致灵敏度不足；受反应物均相溶液中随机碰撞和自由扩散的影响，反应动力学缓

慢等问题。因此，亟需开发新的信号扩增策略，克服上述干扰，实现在复杂的细胞

环境中对miRNA的高灵敏，高选择性原位成像。将催化杂交DNA自组装反应限

制在一个相对紧凑的空间内，可以使分子间反应转变为分子内反应，从而维持高的

局部有效浓度，为解决上述问题提供了新的思路。传统的限域反应设计思路通常是

将发夹反应物探针限制在DNA纳米材料（如DNA纳米线、立方体和四面体）上，

以提高生物标志物检测的灵敏度。然而，这些限域DNA线路存在序列设计复杂、

背景信号大、容易发生非特异性相互作用等缺陷。相比之下，回文序列作为连接序

列可以相互杂交以组装成较大的DNA纳米结构。大尺寸的产物在活细胞中扩散缓

慢，不容易改变位置，对于活细胞中的miRNA的原位成像具有十分重要的意义。

因此，我们结合恒温无酶核酸扩增技术，通过模块化设计，设计了回文序列构建的

限域DNA线路用于灵敏的miRNA检测。

（1）在传统的DNA催化杂交反应基础上，引入回文核酸序列，设计了一种

紧凑、高效的自调节双向自组装DNA线路，用于活细胞内miRNA的精准、灵敏

原位成像。构建模块只需要两条回文发夹型核酸探针，其中一个探针分别用FAM

荧光基团和对应的淬灭剂修饰，用于监测miRNA响应性的双向DNA自组装过程。

部分回文序列被封闭在发夹探针茎部，以阻止非特异性的自组装。在miRNA存在

的条件下，依次激活探针，将分子间反应转变为分子内反应，实现双向介导的DNA

自组装，生成DNA“纳米线”用于原位miRNA检测。这种限域方式显著提升了局

部有效浓度和化学反应速度，避免了复杂的设计过程，并减少了背景信号泄露带来

的假阳性干扰，同时，它也显著提升了DNA线路的信号扩增能力，进而提高了检

测的准确度和可信度。在细胞成像过程中，得益于空间受限的双向自组装获得的级

联信号扩增，构建的线路实现了活体内低丰度miRNA的放大荧光成像，这一研究

策略为活细胞内原位荧光成像低丰度靶标提供了新的研究思路，有望在临床诊断

和预后评估中发挥作用。

（2）引入三个具有回文序列的核酸探针，设计了一种模块化的、自限域催化

核酸线路，通过催化多米诺反应，显著提高了检测灵敏度和线性响应范围。当目标

miRNA存在时，引发发夹探针间的DNA级联反应，从而自组装成高分子量的DNA

“纳米凝胶”结构并释放目标miRNA，实现对目标miRNA的信号放大检测。利

用荧光相关光谱验证了多层DNA纳米结构的组装过程，并利用线路成功区分了癌

细胞和正常细胞，比较了不同细胞中miRNA的表达水平差异，以及乳腺癌患者癌

症组织和癌旁组织中的miRNA表达谱。这些结果进一步证明了该线路的信号扩增

能力。体外和细胞成像实验结果表明，该扩增线路具有优异的miRNA传感性能，

实现了在活细胞内的高原位成像，在分子诊断和疾病评估等领域有着巨大的应用

前景。

关键词：信号扩增，限域核酸线路，回文序列，microRNA成像

DesigingaSelf-ConfinedCatalyticDNACircuitBasedon

PalindromicSequencesforSensitivemicroRNAImaging

ABSTRACT

AccuratedetectionandinsituimaginganalysisofmicroRNA(miRNA