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基因工程重要知识点全面复习材料

一、基因工程的基本概念与原理

基因工程，又称遗传工程或重组DNA技术，其核心在于通过人工手段对生物体的遗传物质（主要是DNA）进行“剪切”、“粘贴”和“重组”，并将重组后的DNA分子导入到宿主细胞中，使其能够稳定遗传并表达出新的性状。这一技术的理论基础是不同生物的遗传物质具有共同的化学本质（脱氧核糖核酸）和基本相同的遗传密码，从而使得一种生物的基因能够在另一种生物体内被识别和表达。其最终目标通常是获得具有特定性状的转基因生物，或高效生产特定的基因产物。

二、基因工程的核心工具

基因工程的操作离不开一系列关键的工具酶和载体系统，它们是实现DNA体外重组的基础。

（一）限制性内切核酸酶

这类酶是基因工程中的“分子剪刀”，能够识别并切割双链DNA分子中的特定核苷酸序列（限制性位点）。

*类型与特点：常见的有I型、II型和III型。基因工程中最常用的是II型限制性内切酶，它们能在识别位点内部或附近特异性切割DNA，产生具有粘性末端（如5突出或3突出）或平末端的DNA片段。

*识别序列：通常为回文序列，即双链DNA中一条链从5到3的序列与另一条链从5到3的序列完全相同。

*切割方式：粘性末端的产生使得不同DNA片段的互补末端能够通过碱基配对退火，便于后续连接；平末端则需要特定的连接酶或处理才能进行有效连接。

（二）DNA连接酶

作为“分子胶水”，DNA连接酶的作用是催化两个双链DNA片段的3羟基和5磷酸基团之间形成磷酸二酯键，从而将它们连接成一个完整的DNA分子。

*常用类型：T4DNA连接酶是基因工程中最常用的连接酶，它既可以连接粘性末端，也可以连接平末端（效率较低，常需辅助手段）。

*连接条件：需要ATP作为辅助因子，并依赖一定的温度和pH条件。

（三）DNA聚合酶

DNA聚合酶在基因工程中主要用于DNA链的合成与延伸。

*DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）：Klenow片段保留了DNA聚合酶活性和3→5外切酶活性，常用于填补粘性末端、cDNA第二链合成、DNA测序等。

*TaqDNA聚合酶：具有热稳定性，是聚合酶链式反应（PCR）技术的核心酶。

（四）载体

载体是能够携带外源目的基因进入宿主细胞并进行复制和表达的DNA分子。

*载体的基本条件：具备复制起点，能在宿主细胞中独立复制；具有多个单一的限制性内切酶识别位点（多克隆位点，MCS），便于外源基因插入；带有筛选标记基因（如抗生素抗性基因、营养缺陷型互补基因等），用于筛选含重组载体的宿主细胞；分子量相对较小，拷贝数较高，便于操作和分离。

*常用载体类型：

*质粒载体：最常用，如pBR322系列、pUC系列，适用于原核细胞。

*噬菌体载体：如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体，常用于构建基因组文库或cDNA文库，以及DNA测序。

*病毒载体：如逆转录病毒载体、腺病毒载体等，常用于真核细胞的基因转移。

*人工染色体载体：如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）等，用于克隆大片段DNA。

三、基因工程的基本操作流程

基因工程的操作通常遵循一系列有序的步骤，尽管具体实验方案会因目标和体系不同而有所差异，但其核心流程相似。

（一）目的基因的获取

这是基因工程的起始步骤，获取目的基因的方法多样：

*从基因文库中筛选：包括基因组文库和cDNA文库。

*PCR扩增：根据已知序列设计引物，通过PCR技术快速扩增目的基因片段。

*化学合成：对于分子量较小的基因或已知序列的寡核苷酸片段，可采用化学合成法。

*从基因数据库中获取并委托合成：随着测序技术发展，许多基因序列已公布，可直接获取序列信息后委托专业公司合成。

（二）载体的选择与制备

根据目的基因的大小、宿主细胞的类型以及实验目的（如克隆、表达、测序等）选择合适的载体。选定载体后，通常需要用限制性内切酶对其进行酶切，以产生与目的基因片段匹配的末端，便于连接。

（三）目的基因与载体的连接（重组DNA的构建）

利用DNA连接酶将酶切后的目的基因片段与载体片段连接起来，形成重组DNA分子（重组子）。连接策略包括粘性末端连接、平末端连接、同聚物加尾连接、人工接头连接等。

（四）重组DNA导入宿主细胞

将构建好的重组DNA分子导入到能够进行复制和表达的宿主细胞中。

*原核细胞转化：常用方法有氯化钙法（化学转化法）、电击转化法等。

*真核细胞转染：如磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、显微注射法、电击穿孔法、病毒介导的转导等。

（五）重组子的筛选与鉴定

导入重组DNA后，需要从大量宿主细胞中筛选出含有目的重组子的阳性克隆，并进行鉴定。

*基于载体标记基因的筛选：如抗生素抗性筛选、蓝白斑筛选（利用