组织学技术与免疫组化讲课文档.pptxVIP

组织学技术与免疫组化;实验用移液器的使用;[Imageinformationinproduct]

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Youmaynotextracttheimageforanyotheruse.;;1.移液之前，要保证相同温度。吸取液体时，保持竖直状态，将枪头插入液面下2－3毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）切忌Tip头在液体里吹泡泡。

一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。

二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体。;千万不要将旋钮旋出量程;;;实验材料

?

仪器：电子天平

试剂：蒸馏水

移液器(P1000/P200/P20)

尖端管（枪头）(1000ul/200ul)?

小量杯?

;;;;;禹晓童，杨燕琳，陈栎

北京大学第三医院中心实验室

2016-12-3;中心实验室组织病理学分析平台;全套病理分析设备;第十七页，共173页。;专业技术人员;免疫组织化学技术;免疫组织化学技术;第一个问题：为什么选择采用

免疫组织化学技术这种实验方法？;导师安排课题;查文献、看综述;B疾病/病变/状态;DNA;DNA;DNA;DNA;DNA;mRNA;蛋白;蛋白;WesternBlotting;FCM;ELISA;免疫组化;免疫组化;WesternBlotting;中心法则(CentralDogma);免疫组织化学技术(IHC);第四十一页，共173页。;;;商品化抗体;多克隆抗体

(polyclonalantibody，pAb);分泌抗体;单克隆抗体

(monoclonalantibody，mAb);;;;标记物发光;;第五十三页，共173页。;第五十四页，共173页。;1.抗体公司网站，查询抗体;2.下载抗体说明书，仔细阅读，选定一抗;Mouse;;;;DAB;;CEA，BCIP/NBT;;;;实验前准备;标本;根据特定实验内容，确定取材、固定方案;组织细胞取材固定的基本流程;活细胞;做特定实验前，必须进行HE染色观察组织质量;;免疫组织化学技术实验步骤;脱蜡和水化;脱蜡和水化;脱蜡和水化;脱蜡和水化;高温高压热修复：

(1)取一定量的0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）于压力锅中。

(2)将切片置于耐高温塑料切片架???，切片位于液面以下，盖锅加阀，高火加热至加压阀快速喷气，调电炉至100度计时2min。

(3)压力锅离开热源，冲水快速冷却开盖，晾凉至室温。;脱蜡和水化;脱蜡和水化;脱蜡和水化;一抗的稀释度;;免疫组织化学技术实验步骤;免疫组织化学技术实验步骤;免疫组织化学技术实验步骤;免疫组织化学技术实验步骤;免疫组织化学技术实验步骤;DAB显色;DAB显色时间;DAB显色时间;免疫组织化学技术实验步骤;免疫组织化学技术实验步骤;细胞核内脱氧核糖核酸（DNA）呈酸性，易与带正电荷的苏木精碱性染料结合。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，故细胞核被染成蓝色。;免疫组织化学技术实验步骤;分化：过染的细胞核和不应着染苏木精的细胞浆等组织成分脱色，从而使着染的细胞核与细胞浆及细胞周围的组织成分对比清晰。分化时间的长短视组织性质，切片厚薄，苏木素染色深浅和分化液的新旧来决定，一般是2-5秒钟，若切片不分化或分化不足，细胞核和细胞浆均着染，使组织结构对比不清晰；若分化过度，细胞核过淡或褪色。

返蓝：碱性溶液使苏木素恢复蓝色。;免疫组织化学技术实验步骤;95%乙醇2min×2次，无水乙醇2min×2次，二甲苯替代物5min×2次;免疫组织化学技术实验步骤;中性树胶封片。

切片阴干，避免强光照射。

三天后，等树胶完全干燥后，尽快进行图像采集。;染色前处理

取材、脱水、浸蜡、脱钙

组织固定

为确保离体组织的抗原性，组织离体后一般在15min内固定，固定液体积为组织体积的10-15倍，常温下固定8-24hr或4℃固定一周，尽快脱水包埋。

中性甲醛固定可引起组织抗原决定簇的封闭和交联，必须通过抗原修复进行修正。

中性甲醛和70%乙醇固定时间过长，会造成组织抗原损失，新鲜组织固定一周后抗原丢失严重，几乎不能被检出。;防脱片

在整个实验操作流程中都必须防脱片。黏附载玻片。

切片厚度不宜超过5μm，切片