蛋白质的定量测定一双缩脲法.pptVIP

第1页，共24页，星期日，2025年，2月5日蛋白质含量测定引言：蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。第2页，共24页，星期日，2025年，2月5日目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：物理性质：紫外分光光度法。化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：免疫比浊法。第3页，共24页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的定量测定——双缩脲法实验目的要求1、学习分光光度法原理，了解分光光度计的结构。2、掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理及方法。3、了解标准曲线的制作方法及其在物质定量测定中的应用。第4页，共24页，星期日，2025年，2月5日分光光度法原理分光光度法，常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。第5页，共24页，星期日，2025年，2月5日Lambert定律一束平行单色光垂直照射于一均匀物质（溶液）时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光线强度的减弱也愈显著。设：入射光强度为I0L表示溶液的厚度（即光程）出射光（透过光）强度为I根据辐射能理论推导，I0与I之间关系为lg（I0/I）=K1L（1）K1是常数，受光线波长、溶液性质、溶液浓度的影响。第6页，共24页，星期日，2025年，2月5日Beer定律当一束单色光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若溶液的厚度不变，则溶液浓度C愈大，光吸收愈大，透射光线强度的减弱也愈显著，光强度减弱的量与溶液浓度增加量成正比lg（I0/I）=K2C（2）K2为吸收系数，是常数，溶液对光吸收的大小与溶液浓度C成正比。第7页，共24页，星期日，2025年，2月5日Lambert-Beer定律（又称吸收定律）上二式合并（即（l）与（2）合并）lg（I0/I）=?CL令A=lg（I0/I），T=I/I0；则A=?CL，A=-lgT。T为透光率，A为吸光度（光密度、消光度）。其中?为常数，又称消光系数（extinctioncoefficient），表示物质对光线吸收的能力，其值因物质种类和光线波长而异。对于相同物质和相同波长的单色光则消光系数不变。第8页，共24页，星期日，2025年，2月5日分光光度计的结构光源：钨灯和氢灯（或氘灯）单色器：分解为单一波长光的装置狭缝：调节入射单色光的强度，形成平行光线吸收池：又称比色杯、比色皿、比色池，装待测溶液用检测系统：感受光能，转化为电能，输出A值、T值。第9页，共24页，星期日，2025年，2月5日本室几类分光光度计22PC型可见光分光光度计UNICO2000型第10页，共24页，星期日，2025年，2月5日S54型紫外分光光度计UV8500型紫外分光光度计第11页，共24页，星期日，2025年，2月5日比色杯（比色皿）玻璃比色杯石英比色杯荧光比色杯第12页，共24页，星期日，2025年，2月5日比色杯使用注意事项1、拿取比色皿时，只能用手指接触两侧的毛玻璃，避免接触光学面。

2、不得将光学面与硬物或脏物接触。盛装溶液时，高度为比色皿的2/3处即可，光学面如有残液可先用滤纸轻轻吸附，然后再用檫镜纸擦拭。

3、比色皿在使用后，应立即用水冲洗干净。必要时可用1：1的盐酸浸泡，然后用水冲洗干净。

4、不能将比色皿放在火焰或电炉上进行加热或干燥箱内烘烤；

5、在测量时如对比色皿有怀疑，可自行检测。第13页，共24页，星期日，2025年，2月5日微量移液器吸嘴装在吸液杆上，应套牢避免间隙。依据所需容量旋转手轮，使数轮显示所需值。轻轻地将推动按钮下压，使推动按钮推移至第一停点位置。手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度为2-4mm，停留2-3秒后缓慢放松按钮，即回到原来位置，溶液吸入后稍停即可将吸嘴移