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检验科甲型流感实验室检测流程
演讲人：
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CATALOGUE
样本接收与登记
样本处理与核酸提取
检测实验操作
结果分析与判读
报告出具与沟通
质量控制与安全防护
01
样本接收与登记
PART
接收标准与验证
确保样本容器无破损、标签清晰可辨，核对样本类型（如鼻咽拭子、咽拭子）与申请单一致，避免因运输不当导致的样本失效。
样本完整性检查
生物安全评估
时效性确认
验证样本是否采用三级生物安全包装，检查外包装消毒记录及运输温度是否符合冷链要求，防止交叉污染或病毒灭活。
评估样本采集至送达实验室的时间间隔，确保在有效检测窗口期内，避免因延迟导致RNA降解或假阴性结果。
登记信息规范
双人核对机制
由两名工作人员独立录入样本编号、患者姓名、检测项目及临床诊断信息，确保电子系统与纸质记录完全一致，减少人为差错。
关键字段标准化
强制填写字段包括样本来源科室、采集时间、送检医师联系方式，并采用下拉菜单规范填写格式（如“甲型流感筛查”或“确诊复核”）。
异常情况标注
对特殊样本（如溶血、量不足）在系统中标记备注栏，并自动触发预警提示检测人员优先处理或联系补样。
分级存储策略
通过条码系统实时记录样本存取时间、位置及操作人员，设置库存阈值报警，防止因堆积导致检测延误或样本混淆。
动态库存监控
环境参数记录
每日监测存储设备温度、湿度及CO₂浓度（如适用），数据自动上传至LIS系统并生成质控曲线，确保样本稳定性可追溯。
未处理样本按生物安全等级分类存放，高危样本置于-80℃超低温冰箱，常规样本在4℃冷藏柜保存不超过48小时，避免反复冻融。
样本暂存管理
02
样本处理与核酸提取
PART
离心与分装步骤
样本离心参数设定
样本保存条件
分装操作规范
采用低温高速离心机，设定离心力与时间以确保病毒颗粒有效沉淀，同时避免样本中核酸降解。离心后需静置观察分层情况，确保上清液无悬浮颗粒干扰后续检测。
使用无菌EP管进行分装，每管体积需严格一致并标注唯一标识码。分装过程需在生物安全柜内完成，避免交叉污染和环境气溶胶扩散风险。
分装后样本需立即转移至-80℃超低温冰箱保存，若需短期存放应确保-20℃环境稳定，避免反复冻融导致核酸完整性受损。
通过裂解液释放病毒核酸后，磁珠表面硅基团特异性吸附核酸，经洗涤去除蛋白质和抑制剂，最终洗脱获得高纯度RNA。该方法适用于高通量自动化提取，回收率可达90%以上。
核酸提取方法应用
磁珠法提取原理
硅胶膜离心柱利用核酸在高盐条件下与膜结合的特性，通过多次离心和缓冲液置换实现纯化。需注意离心速度与时间匹配，防止膜破裂或核酸残留。
柱式提取技术要点
手工提取成本低但操作变异大，自动化平台如QIAcube可标准化流程，减少人为误差，尤其适合大规模筛查场景。
手工提取与自动化平台对比
质量控制点设置
内参基因检测
在提取环节加入内源性人源基因（如RNaseP）作为提取效率监控，Ct值超出阈值范围需重新评估样本质量或重复提取。
核酸浓度与纯度评估
采用紫外分光光度计检测A260/A280比值（1.8-2.0为合格），并利用荧光定量仪验证RNA完整性，排除降解样本对PCR扩增效率的影响。
阴性对照与空白对照
每批次检测需包含无模板对照（NTC）和提取空白对照，用于识别试剂污染或交叉污染，确保结果特异性。
03
检测实验操作
PART
RT-PCR试剂准备
试剂配制标准化
分装与保存规范
阴性/阳性对照设置
严格按照试剂盒说明书配制反应体系，包括引物、探针、酶混合液及缓冲液，确保各组分浓度精确，避免因比例失衡导致假阴性或假阳性结果。
每批次检测需包含无核酸酶水作为阴性对照，以及已知甲型流感病毒核酸片段作为阳性对照，用于监控实验系统性能和交叉污染风险。
配制完成的试剂需分装至无菌离心管中，标注批次及有效期，短期使用置于4℃保存，长期储存需-20℃以下环境，避免反复冻融影响活性。
加样与扩增程序
样本核酸提取质量控制
采用磁珠法或柱提法提取病毒RNA，通过紫外分光光度计检测A260/A280比值（1.8-2.0）及浓度，确保提取核酸纯度满足后续扩增要求。
反应体系构建
在超净工作台或生物安全柜内完成加样，使用低吸附枪头避免气溶胶污染，每孔加入模板RNA、预混试剂及内标，覆盖光学封板膜防止蒸发。
扩增参数优化
设置三步法循环条件（逆转录、预变性、扩增），根据引物Tm值调整退火温度，循环数控制在40-45次，避免非特异性扩增或信号饱和。
仪器校准与基线设置
实时观察扩增曲线形态，标准曲线斜率应介于-3.1至-3.5之间，相关系数R²0.98，Ct值在15-35区间内视为有效结果。
动态范围监控
数据复核与异常处理
对临界值样本（Ct值35-38）需重复检测，结合熔解曲线分析（Tm值±1℃）确认特异性，排除引物二聚体或污染干扰
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