基因工程第一章酶.pptVIP

同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。第62页，共102页，星期日，2025年，2月5日衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A第63页，共102页，星期日，2025年，2月5日衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。第64页，共102页，星期日，2025年，2月5日衔接物连接法第65页，共102页，星期日，2025年，2月5日双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI第66页，共102页，星期日，2025年，2月5日在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。第67页，共102页，星期日，2025年，2月5日DNA接头（adapter）连接法：1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5’-P，暴露出5’-OH，不能产生稳定的二聚体分子。第68页，共102页，星期日，2025年，2月5日第69页，共102页，星期日，2025年，2月5日DNA接头连接法第70页，共102页，星期日，2025年，2月5日热稳定的连接从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。寡核苷酸连接测定（oligonucletideligationassay,OLA）用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶DNA分子的位置是相邻的。连接酶链式反应（lingasechainreaction,LCR）；也叫连接扩增反应（lingaseamplicationreaction）用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物，第71页，共102页，星期日，2025年，2月5日寡核苷酸连接测定AGTGACCTTCACTGGAAGTGACCTAGTTACCTTCACTGGATCACTGGAAGTGACCTACCTAGTGACCTACCT待扩增的DNA片断PPBBDD地高辛配基