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磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体的制备及对DNA作用机制研究

一、引言

1.1研究背景

基因治疗作为一种极具潜力的治疗手段，为众多难治性疾病的攻克带来了新希望。从1972年《科学》杂志正式提出基因疗法的概念以来，基因治疗领域取得了长足的发展。它旨在将正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病。在过去几十年间，基因治疗在遗传性疾病、癌症、心血管疾病等诸多领域展开了广泛的研究与临床试验，成为了医学研究的热点之一。

在基因治疗中，基因载体起着至关重要的作用。理想的基因载体需要具备高效的基因递送能力、良好的生物相容性、低免疫原性以及安全性等特点。目前，基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，虽具有较高的转染效率，但存在引发免疫反应、病毒野生型突变以及潜在致癌性等风险。例如，1999年首位在基因疗法中死亡的患者，就是在接受基因治疗后出现了致命的免疫应答，这一事件凸显了病毒载体的安全性隐患。

非病毒载体因其安全性较高、免疫原性低等优势，逐渐受到人们的关注。壳聚糖作为一种天然的高分子多糖，是甲壳素的脱乙酰衍生物，具有良好的生物相容性、生物可降解性、低细胞毒性和无免疫原性等优点，且本身具有一定的抑制微生物和抗癌作用，成为了非病毒基因载体的研究热点之一。在酸性条件下，壳聚糖氨基质子化带正电，可与带负电荷的DNA通过静电作用和氢键结合，形成相对致密的纳米级多聚复合物。这种纳米级多聚复合物不仅增强了DNA抵抗核酸酶的能力，有利于细胞对DNA的摄取，还能在制备过程中避免采用超声波生物降解和加入有机溶剂，使配位过程中DNA可能受到的破坏最小化，并且装载DNA的壳聚糖微粒在储存时较为稳定。

然而，壳聚糖作为基因载体也存在一些不足之处。其转染效率相对较低，在生理环境下的稳定性有待提高，且溶解性较差，限制了其在基因治疗中的广泛应用。为了克服这些缺点，对壳聚糖进行改性成为了研究的重点方向之一。磷酰胆碱基团（phosphorylcholine，PC）是细胞膜基本单元卵磷脂的亲水端基，是细胞外层膜中外层官能团，具有良好的生物相容性和抗凝血性。将磷酰胆碱接枝到壳聚糖上，有望综合两者的优势，制备出性能更优异的基因载体。通过接枝磷酰胆碱，可能改善壳聚糖的溶解性、稳定性，提高其转染效率，从而为基因治疗提供更有效的载体选择，这也使得磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体的研究具有重要的必要性和迫切性。

1.2研究目的与意义

本研究旨在制备磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体，并深入探究其对DNA的作用。通过优化制备工艺，获得具有良好性能的磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体，包括合适的粒径、较高的载药量、良好的稳定性等。同时，系统研究该基因载体与DNA的相互作用机制，如结合能力、保护能力以及对DNA释放行为的影响等。

从理论意义上看，深入研究磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体对DNA的作用，有助于进一步理解非病毒基因载体与DNA的相互作用规律，丰富基因载体的理论研究。揭示磷酰胆碱基团的引入如何影响壳聚糖基因载体的性能和作用机制，为设计和开发新型、高效的基因载体提供理论依据，推动基因治疗领域的基础研究发展。

在实践意义方面，若能成功制备出性能优良的磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体，将为基因治疗提供一种新的、安全有效的载体选择。提高基因治疗的效果，降低治疗风险，有望应用于多种疾病的治疗，如遗传性疾病、癌症等，为这些疾病的临床治疗带来新的突破和希望，具有重要的临床应用价值和社会经济效益。

1.3国内外研究现状

壳聚糖作为基因载体的研究在国内外都受到了广泛关注。国外早在20世纪90年代就开始了对壳聚糖基因载体的研究，在壳聚糖的改性、制备工艺以及作用机制等方面取得了一系列成果。研究发现通过对壳聚糖进行化学修饰，如季铵化、羧甲基化等，可以改善其溶解性和转染效率。在制备工艺上，复凝聚法、乳化交联法等被广泛应用于制备壳聚糖纳米粒基因载体，并且对这些制备工艺的条件优化和影响因素进行了深入研究。

国内对壳聚糖基因载体的研究起步相对较晚，但发展迅速。国内研究人员在借鉴国外研究成果的基础上，结合我国实际情况，在壳聚糖基因载体的研究方面也取得了显著进展。在壳聚糖的改性研究中，开发了多种具有自主知识产权的改性方法，制备出了一系列性能优良的壳聚糖衍生物基因载体。同时，在壳聚糖基因载体的体内外评价、靶向性研究等方面也开展了大量工作。

对于磷酰胆碱接枝壳聚糖基因载体的研究，国外已有一些相关报道。通过溶液自由基聚合等方法合成甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（MPC）-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅（TSMA）二元共聚物，并将其涂覆在壳聚糖表面，通过催化交联获得具有仿细胞外层膜结构的磷酰胆碱接枝壳聚糖，研究表明其抗凝血性能显著提高，