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4.Ⅱ型RE的反应条件(1)标准酶解体系的建立一个单位的限制性核酸内切酶定义为:在合适的温度和缓冲液中,在20μL反应体系中,1h完全降解1μgDNA所需要的酶量。第29页，共62页，星期日，2025年，2月5日（2）酶解过程1.酶解体系2.混匀3.反应终止4.酶解结果鉴定第30页，共62页，星期日，2025年，2月5日（2）酶解过程酶切反应体系质粒DNA1.5μl10×MCbuffer2.0μlBamHⅠ0.2μlBSA0.1μlddH2Otototal20.0μl第31页，共62页，星期日，2025年，2月5日RE酶切反应的终止65℃5min使大多数RE钝化。对不易印钝化的需特殊方法，如加SDS或尿素，但两者不易从DNA中去除。需抽提才可以。（方法同DNA提取的抽提）第32页，共62页，星期日，2025年，2月5日5.影响RE活性的因素（1）DNA纯度DNA制剂中，Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA，高盐浓度等，影响RE的活性。提高酶切效率方法：1.增加RE用量≥100U/μl2.扩大反应体积以使潜在的抑制因素相应稀释3.延长酶切时间第33页，共62页，星期日，2025年，2月5日（2）DNA甲基化程度甲基化作用会强烈影响酶活性。基因工程中用的菌株为丧失了甲基化酶的。不同位点之间的甲基化程度是不相同的且与DNA来源的细胞类型有密切关系。用处：1.改变RE的识别序列的特异性。2.酶切前保护内部识别位点第34页，共62页，星期日，2025年，2月5日（3）酶切反应温度不同RE具有不同的最适反应温度一般为37℃也有例外如SmaI25℃ApaI30℃高于可低于最适反应温度会导致酶失活第35页，共62页，星期日，2025年，2月5日（4）DNA分子结构超螺旋比线性DNA需酶量大，最高可达20倍另外切割于不同DNA部位的限制位点时，效率也不同，但最多不会相差10倍第36页，共62页，星期日，2025年，2月5日（5）RE的缓冲液缓冲液组分包括：①Mg2+；②Tris-Hcl使pH处于最佳数值范围内③保护酶稳定性的物质β-巯基乙醇、（DDT)、（BSA)第37页，共62页，星期日，2025年，2月5日星号活性：非特适条件（酶浓度高，甘油高、代离子强度，高pH）等常使酶发生不正确切割，切割特异性。第38页，共62页，星期日，2025年，2月5日5.RE对DNA的消化作用第39页，共62页，星期日，2025年，2月5日（1）限制性内切酶对DNA的局部消化理论上：一条DNA分子上4种核苷酸量相等。 NNNN GATC?x?x?x?=1/256则6Base(?)6=1/40968base(?)8=1/65,536第40页，共62页，星期日，2025年，2月5日则RE的识别频率为：1/4NN为核苷酸的识别序列的碱基数即每隔4N个碱基就切割一次DNA第41页，共62页，星期日，2025年，2月5日完全酶切消化（completedisestion)如果一种RE对DNA分子的切割达到了这样的片段（4N）的水平称之为完全酶切消化第42页，共62页，星期日，2025年，2月5日局部酶切消化（partialdigestion)RE对大量的DNA的消化不进行完全，可获得分子量大小有所增加的限制片段产物，称这为局部酶切消化第43页，共62页，星期日，2025年，2月5日（3）RE对真核DNA的消化作用真核生物基因组大
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